1、饲料粗蛋白质的测定方法（GB/T6432-94） 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用范围 GB 601 化学试剂 滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备 3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。假如强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 4 试剂 4.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为 98%，无氮。 4.2 混合催化剂：0.4g 硫酸铜，5 个结晶水（GB 665），6g 硫酸钾（HG
2、3-920）或硫酸钠（HG 3-908），均为化学纯，磨碎混匀。 4.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40%水溶液（M/V ）。 4.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2%水溶液（M/V ）。 4.5 混合指示剂：甲基红（HG 3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3-1220）0.5 乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。 4.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按 GB 601 制备。 4.6.1 0.1mol/L 盐酸（HCl）标准溶液： 8.3mL 盐酸（GB 622），分析纯，注入 1000mL蒸馏水中。 4.6.2 0.02mol/L 盐酸（HCl
3、）标准溶液：1.67mL 盐酸（ GB 622），分析纯，注入1000mL 蒸馏水中。 4.7 蔗糖（HG 3-1001）：分析纯。 4.8 硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。 4.9 硼酸吸收液：1%硼酸水溶液 1000mL，加入 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 10mL，0.1% 甲基红乙醇溶液 7mL，4% 氢氧化钠水溶液 0.5mL，混合，置于阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。 5 仪器设备 5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 5.2 分样筛：孔径 0.45mm（40 目）。 5.3 分析天平：感量 0.0001g。 5.4 消煮炉或电炉。 5.5 滴定管：酸式，10、25mL 。
4、5.6 凯氏烧瓶：250mL 。 5.7 凯氏定氮装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸馏式。 5.8 锥形瓶：150、250mL。 5.9 容量瓶：100mL 。 5.10 消煮管： 250mL。 5.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 6 试样的选取和制备。 选取具有代表性的样品用四分法缩减至 200g，粉碎后全部通过 40 目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 7 分析步骤 7.1 仲裁法 7.1.1 试样的消煮 称取试样 0.51g（含氮量 580mg）准确至 0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6 ）中，加入 6.4g 混合催化剂（ 5.4），与试样混合均
5、匀，再加入 12mL 硫酸（4.1）和两粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉（ 5.4）上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360 410 ）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少 2h。 7.1.2 氨的蒸馏（蒸馏步骤的检验见附录) 7.1.2.1 常量蒸馏法 将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入 60100mL 蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有 25mL 硼酸（4.4 ）吸收液和 2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶（5.6）中加入 50mL 氢氧化钠溶液（4.3），轻轻摇动凯氏烧瓶（5.6）使溶液混匀后再加热蒸馏，直
6、至流出液体体积为 100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏 12min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 7.1.2.2 半微量蒸馏法 将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入 20mL 蒸馏水，转入 100mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有20mL 硼酸（4.4）吸收液和 2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶（5.8）内。蒸汽发生器（5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此溶液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液 1020mL 注入蒸馏装置的（5.7
7、）反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加 10mL 氢氧化钠（4.3 ），小心提起玻璃塞之之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏 4min 降下锥形瓶（5.8）使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 注：7.1.2.1 和 7.1.2.2 蒸馏法测定结果相近可任选一种。 附录：蒸馏步骤的检验 精确称取 0.2g 硫酸铵（4.8），代替试样，按 7.1.2 或 7.2.2 步骤进行操作，测的硫酸铵含氮量为 21.190.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。 7.1.3 滴定 用
8、7.1.2.1 或 7.1.2.2 法蒸馏后的吸收液立即用 0.1mol/L（4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。 7.2 推荐法 7.2.1 称取 0.51g 试样（含氮量 580mg）准确至 0.0002g，放入消化管中，加 2 片消化片（仪器自备）或 6.4g 混合催化剂（4.2），12mL 硫酸（4.1），于 420下在消煮炉上消化 1h。取出放凉后加入 30mL 蒸馏水。 7.2.2 氨的蒸馏 采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以 25m
9、L 硼酸（4.4）为吸收液，加入 2 滴混合指示剂（4.5），蒸馏装置的末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入 50mL 氢氧化钠溶液（4.3）进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到 100mL 时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。7.2.3 滴定 用 0.1mol/L 的标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液颜色由蓝绿色变成灰红色为终点。 8 空白测定 称取蔗糖 0.5g 代替试样，按第七章进行空白测定，消耗 0.1mol/L 盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过 0.2mL。消耗 0.02mol/L 盐酸标准溶液的体积不得超过 0.3mL。 9
10、 分析结果的表述 9.1 计算见下式： 粗蛋白质（%）= （V 2-V1）C0.01406.25V100/mV 式中：V 2-滴定试样时所需标准盐酸溶液体积，mL； V1-滴定空白所需标准盐酸溶液体积，mL； C-盐酸标准溶液浓度， mol/L； m-试样质量，g； V-试样分解液总体积，mL； V-试样分解液蒸馏用体积，m/L ； 0.0140-每毫克当量氮的克数； 6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。 9.2 重复性 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白含量在 25%以上时，允许相对偏差为 1%。 当粗蛋白含量在 10%25%之间时，允许相对偏差为 2%。 当粗蛋白含量在 10%以下时，允许相对偏差为 3%。
