1、第二章 微生物的纯培养和显微技术,微生物的分离和纯培养 显微镜和显微技术 显微镜下的微生物,“微生物”并非分类学上的名词，是形体微小（0.1mm)、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚至无细胞结构的低等生物的通称。微生物有五大共性：,体积小、比表面积大 吸收多、转化快 生长旺、繁殖快 适应强、易变异 分布广、种类多,1. 体积小、面积大,比面=面积/体积,乳酸杆菌 120,000 豌豆 6.0 鸡蛋 1.5 体重200磅的人 0.3,2 吸收多，转化快,3克地鼠每天消耗与体重等重的粮食； 1克闪绿蜂鸟每天消耗两倍于体重的粮食； 大肠杆菌每小时消耗2000倍于体重的糖。；,发酵乳糖的细菌在1小时内就
2、可以分解相当于其自身重量1,00010,000倍的乳糖，产生乳酸； 1公斤酵母菌体，在一天内可发酵几千公斤的糖，生成酒精；,3 生长旺，繁殖快,例如：Escherichia coli (大肠杆菌)在最适的生长条件下，每12.520分钟细胞就能分裂一次。,在液体培养基中，细菌细胞的浓度一般为108109个/ml。,利用微生物的这一特性就可以: 实现发酵工业的短周期、高效率生产。例如生产鲜酵母时，几乎12小时就可以收获一次，每年可以收获数百次。,谷氨酸短杆菌：摇瓶种子50吨发酵罐：52小时内细胞数目可增加亿倍。,4.种类多、分布广,分布广：如: 万米深海、85公里高空、 地层下128米和427米
3、沉积岩中都发现有微生物存在。,类型 低限 倾向种数 高限 病毒与立克次氏体 1,217 1,217 1,217 支原体 42 42 42 细菌与放线菌 1,000 1,500 1,500 蓝细菌 1,227 1,500 1,500 藻类 15,051 23,100 23,100 真菌 37,175 47,300 68,939 原生动物 24,068 24,068 30,000 总数 79,780 98,727 127,298,微生物的种数，据1972年：,更重要的是在于微生物的生理代谢类型多、代谢产物种类多。,5.易变异、适应强,任何有其它生物生存的环境中，都能找到微生物。而在其它生物不可能生
4、存的极端环境中也有微生物存在。,突变频率一般为10-510-10，但因繁殖快，数量多，与外界环境直接接触，因而在短时间内可出现大量变异的后代。,青霉素产量变异、耐药性变异举例,例如，青霉素生产菌 Penicillium chrysogenum(产黄青霉)的产量1943年为每毫升发酵液中含20单位青霉素，40多年来，经过世界各国微生物遗传育种工作者的不懈努力使该菌产量变异逐渐积累，加上发酵条件的改进，目前世界上先进国家的发酵水平每毫升已超过5万单位，甚至接近10万单位。微生物的数量性状变异和育种使产量提高的幅度之大，是动植物育种工作中绝对不可能达到的。正因为如此，几乎所有微生物发酵工厂都十分重视
5、菌种选育工作。,微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物 研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态 及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。,微生物的基本特点：,小！,微生物的基本特点：,小！,在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；,微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；,培养技术在微生物学中具有重要意义！,在研究中所使用的微生物培养群体：,培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体,混合培养物：含有多种微生物的培养物； 纯培养物： 只有一种微生物的培养物；,通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果,纯培养技术是进行微生物学研究的
6、基础！,第一节 微生物的分离和纯培养,从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。,一、无菌技术,用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；,灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。,消毒（disinfection）：采用较温和的理化因素仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。,防腐（antisepsis）：利用某种理化因素完全一直霉腐微生物的生长繁殖，从而防止食品等发生霉腐的措施。,化疗(chemotherapy):
7、 利用高选择毒力的化学物质来一直宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,试管、瓶子、培养皿等,1887年，R J Petri 发明,Petri dish,高温干热灭菌,高压蒸汽灭菌,试管、瓶子、培养皿等,常用的灭菌方法：,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,2、接种操作,无菌操作：,火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行,2、接种操作,无菌操作：,在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基； 固体培养基； 半固体培养基；,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基； 固体
8、培养基； 半固体培养基；,琼脂,柯赫（Robert Koch） 的助手W Heese和 他的夫人Fran Heese,二、用固体培养基分离纯培养,菌落（colony）：,单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体,众多菌落连成一片,菌苔（lawn）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般 都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微 生物进行分类、鉴定的重要依据（见P14 图2-3）。,（P6 图 2-3）,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,二、用固体培养基分离纯培养,使微生物在
9、固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：,稀释！,二、用固体培养基分离纯培养,1、稀释倒平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！,使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,3、平板划线法,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,稀释摇管法,三、用液体培养基分离纯培养,稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一
10、般应超过95%）表现为不生长。,1878年，Lister 分离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置,注射器的最小吸取量： 0.00062 毫升,四、单细胞（孢子）分离,一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；,操作难度与细胞或个体的大小成反比；,五、选择培养分离,抑制大多数其它微生物的生长；,使待分离的微生物生长更快；,使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。,微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：,（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。）,使待分离的微生物生长“突出”；,直接挑取待分离的微生物的
11、菌落获得纯培养。,五、选择培养分离,1. 利用选择平板进行直接分离,待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制,高温下培养：分离嗜热细菌；,培养基中不含N：分离固氮菌；,培养基加抗生素：分离抗性菌；,五、选择培养分离,1. 利用选择平板进行直接分离,待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物,颜色反应：分离特定的菌株；,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；,利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；,五、选择培养分离,2. 富集培养,从自然界中分离到所需的特定微生物,特定的环境条件,仅适应于该条件的微生物旺盛生长,待分离微生物在群落中的数量大大增加,2. 富集培养,富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之
12、一。营养和生理 条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微 生物的需要。,根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；,分离培养在特定环境中能生长的微生物；,六、二元培养物,培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的 保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。,病毒和宿主细胞；,纤毛虫、变形虫和粘细菌；,微生物学实验室的常规操作程序,六、 菌种保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；,b）污染；,c）死亡；,不衰,不乱,不死,1、菌种的衰退与复壮,菌种衰退：,菌种在培养或保藏过程中，
13、由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,衰退原因：,基因突变，分离现象。,衰退现象：,菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,防止衰退的措施：,1）减少传代次数；,2）创造良好的培养条件；,3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；,4）采用有效的菌种保藏方法；,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,菌种的复壮：,a）纯
14、种分离；,b）通过寄主体进行复壮；,c）淘汰已衰退的个体,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,2、菌种保藏,基本方法：,生活态 （传代）休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑
15、制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,1）低温保藏法 方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 2）石蜡油低温保藏法 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 3）悬液保藏法,1）真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物， 便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。 2）砂土管法 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,传代培养保藏,1）液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中 （ -196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 2）低温冰箱保存,冷冻保藏,干燥保藏法,几种常用菌种保藏方法的比较,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,
