1、1,细 胞 破 碎,北京四环生物制药有限公司王小建,前 言,细胞破碎是了解细胞组成和结构,获得细胞内含物的必要手段。 胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比较紧密,一般方法不易将细胞打破,有些技术虽然可以,但条件严苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一些技术应用。 在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。,3,生物分离过程的一般流程,本章内容,4,细胞分离方式,细胞破碎技术,包涵体的分离与纯化,主要内容,细胞壁结构和组成,1、细胞分离方式,不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微
2、生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。,5,一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中，如促红细胞生成素等。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤或离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎
3、技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续分离纯化做好准备工作。,6,1、细胞分离方式,7,几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物,8,2、细胞壁结构和组成,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。,2、细胞壁结构和组成,微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质膜和细胞壁组成,其结构影响着细胞破碎。 胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要由蛋白质和脂类组成。没有
4、细胞壁时,膜对渗透休克敏感,对其它破碎方法影响较小。 细胞壁是破碎的主要障碍,其组成和结构对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关,但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。,2、细胞壁结构和组成,1964年Salton首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。尤其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。除了菌质和一些L-型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。,11,2.1 细胞壁结构对破碎的影响,微生物细胞和植物细胞外层均为细
5、胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,几种微生物细胞壁的结构及组成,12,13,2.2细菌细胞壁结构及组成,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强度。,14,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。 革
6、兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物，例如我公司生产的重组人白介素-2、重组人粒细胞刺激因子等。,2.2细菌细胞壁结构及组成,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁构造,15,虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但革兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50 nm，含有40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。革兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层(1.5-2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白
7、，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。,16,2.2细菌细胞壁结构及组成,17,2.3酵母细胞壁结构及组成,酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为70nm，且随培养时间的增加细胞壁加厚。酵母细胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白质，但不清楚以怎样的方式结合形成基本结构。在葡聚糖链上有(1,3)和(1,6)键联结的分支链结构。酵母细胞壁的甘露聚糖主要是由(1,2)糖苷键和少量的(1,3)糖苷键联结的甘露糖组成，另外，也有通过(1,6)糖苷键联结的甘露寡糖侧链，在甘露糖残基上有时也有磷酸二酯键。在酵母细胞壁上发现的蛋白质主要是与甘露糖复合，多数
8、是酶，而不是结构组分。,18,2.3酵母细胞壁结构及组成,酵母细胞壁结构示意图外层甘露聚糖(M)通过磷酸二酯键与蛋白(P)结合，内部蛋白含有交联的糖原(G),微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，因此表现为极其丰富的多样性。利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。,19,3、 细胞破碎技术,目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不
9、同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。,20,3、 细胞破碎技术,21,3、 细胞破碎技术,22,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,3.1细胞破碎方法及其原理,3、 细胞破碎技术,23,细胞破碎机理图,2
10、4,3.2.1高压匀浆法,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。,3.2机械破碎法,3、 细胞破碎技术,25,高压匀浆器的种类,高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 丹麦APV公司R5-12.38型 处理量130L/h,高压匀浆机,26,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约2-3/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多次破
11、碎操作中需要设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。*在工业规模的细胞破碎中，为了提高破碎的效率常采用多次循环的操作方法。,匀浆机配套冷却装置,27,28,升高压力有利于破碎， 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。,影响高压匀浆器细胞破碎因素,29,3.2.2超声波破碎,超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-
12、25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,3.2机械破碎法,30,超声波破碎的机理,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation), 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,超声破碎仪CPX-600型,31,32,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物
13、的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,33,3.2.3匀浆和超声波破碎方法比较,3.2机械破碎法,34,酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法溶胞 其中酶法和化学法溶胞应用最广。,3.3 非机械破碎方法,35,3.3.1酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通
14、透性。溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。,3.3 非机械破碎方法,36,真核细胞与原核细胞比较,37,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,38,酶解法的优缺点,优点： 发生酶解的条件温和； 能选择性地释放产物； 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等； 但酶水解价格高，故小规模应用较广；缺点： 溶酶价格高 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) 产物抑制的存在。
15、,39,3.3.1.1外加酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,3.3.1酶解（
16、酶溶法 Enymatic lysis),40,3.3.1.1外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,41,3.3.1.2酶解-自溶作用,自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生
17、其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,42,3.3.2渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。,3.3 非机械破碎方法,43,3.3.3冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水
18、性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。,3.3 非机械破碎方法,44,3.3.4干燥法,经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。,3.3 非机械破碎方法,45,3.3.5化学法,采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质等从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等； 合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，
19、离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 ； 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ；,3.3 非机械破碎方法,46,化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。,3.3.5
20、化学法,47,3.4破碎率及其测定方法,破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目标。为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方法。,48,3.4破碎率及其测定方法,细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y(%)=(N0-N)/N0100 N0原始细胞数量 N经一段时间操作后保留下来的未损害完整
21、细胞数量 测定方法 直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法,xR/Rm R:破碎后释放的化合物的量 Rm:理论最大释放量,49,直接测定法 在血球计数板用显微镜可直接计数完整细胞的量，所以可用于破碎前的细胞计量。然而破碎过程中所释放的物质如DNA和其它聚合物干扰计数时，可采用染色法把破碎的细胞区别开来，以便于计数。例如，破碎的革兰氏阴性菌常可用结晶紫快速染色，在显微镜下观察在视线范围内是否有完整的菌体存在。 对于量大的样品，显微镜计数法耗时，枯燥；电子粒子计数器虽可测定酵母细胞破碎率，但大的细胞破碎物可能有干扰；用于细菌破碎率的测定时,灵敏度较低。,3.4破碎率及其测定方法,50,间接测定法
22、 依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到100%的标准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差别而产生误差。 当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进行校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物质测定。因此需使用新的方法。,3.4破碎率及其测定方法,51,(1)稀释法,如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎样品(Cu)和稀释样品(Cd)的上清液中的可溶性蛋白来测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数(Fd)
23、,Fd=(Vd/Vs)Cd/(Cu-Cd) Vd为加到体积为Vs的破碎样品中的稀释剂体积。使用Folin-Lowry法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质(Rp)，Rp=Fd(Cu/X) X是以干物重为基础的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必须测定相当于破碎率为100%的Rp值。,52,(1)稀释法,一般来说，水相体积百分数Fd与样品的稀释量无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。,53,(2)质量平衡法,破碎样品的水相体积分数(F)与样品破碎前的水
24、相体积分(Fo)及完整细胞内的含水量(质量分数M)的关系为：F=Fo+(1-Fo)M R(Qc/Qaq)R为细胞破Qc为细胞密度，而Qaq为水悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相(Cn)和未破碎细胞(Cno)的氮含量表示蛋白含量，它们与F和R的关系为：R=FCn/CnoX,54,(2)质量平衡法,将两式合拚，删去F项，得R=Fo Cn/Cno X -(1-Fo)Cn M(Qc/Qaq) 当细胞浓度(X)高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。X=Qc Qaq W(1-M)/W(Qaq-Qc) + Q
25、c(1-M) 使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平衡法测定细胞破碎率。,55,(3)电导率测定法,电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。 这种方法需要有其它方法作对比。因为电导与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定的准确，除破碎率以外,必须在保持的其它所有条件恒定的情况下进行。,56,3.5机械和非机械破碎方法的比较,57,
26、3.5机械和非机械破碎方法的比较,58,3.5机械和非机械破碎方法的比较,机械粉碎法：处理量大，破碎速度较快。细胞受到由高压产生的高剪切力，大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏 酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。 选择合适的破碎方法需要考虑的因素：细胞的数量，目的产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；破碎程度及破碎速度等。,59,细胞破碎是为目标产物的释放创造条件，为了最大程度的获得活性产物，而不是最终目的
27、。,每一步都应注意全面考虑操作度、对细胞的剪切程度、蛋白酶的失活作用等。 在选择细胞破碎时也要考虑后面的各步。,3.6破碎方法的选择,60,3.6.1选择破碎方法的依据：,细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放,61,3.6.2选择性释放目标产物的一般原则,提取产物在细胞质内，用机械法破碎； 提取产物在细胞膜附近，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结融化法等。 提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 ，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂
28、如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出； 另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度；,62,综合说明,由于细胞之间及目标产物之间性质差异很大，已有的破碎理论、破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据。 实际的破碎操作仍凭经验，即通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作参数，获得最佳破碎效率。 提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标产物的变性或失活。,63,3.7细胞破碎技术未来研究发展方向,过度的破碎释放大量的胞内产物，给下游的分离纯化操作增加难度。,破碎操作应与整个
29、下游加工过程相联系，在保证目标产物有效高收率的前体下，使下游加工过程的成本最低。,64,3.7细胞破碎技术未来研究发展方向,每种细胞破碎技术都有不足和应用的局限性。即使工业上应用的破碎技术，如球磨破碎、冷压释放破碎和高压释放破碎等，虽然有破碎效率高、成本低、简便等优点，但也有其不足,如因细胞破碎度高，胞内含物全部释放，大量的杂蛋白和核酸的释放使破碎物粘度很高，给后序的固-液分离带来困难，给产物分离纯化增加了负担；机械破碎的剪切力高，或因产生大量热量，易造成敏感的生物活性物质的失活。化学法虽然目前主要在实验室内小规模应用，大规模工业应用还存在许多问题，但也有许多独特的优点。因此，细胞破碎技术本身
30、还远未达到完善的地步，还有大量的工作可做。 近几年有关文献仍然不少，特别是从上游和下游以及细胞破碎技术之间的相互融合和联系出发，发展了一些新方法。,65,多种破碎方法结合 与上游过程结合1、培养过程控制2、寄主细胞选择3、克隆噬菌体溶解基因4、耐高温产品的基因表达 与下游结合从后分离过程考察细胞破碎技术,3.7细胞破碎技术未来研究发展方向,66,1）多种破碎方法相结合,原理：化学方法细胞壁的化学组成，机械法细胞结构的机械强度。细胞壁的组成影响细胞的机械强度采用二种方法相结合可利于细胞破碎。 如用蜗牛酶预处理面包酵母菌细胞，然后高速匀浆。在95MPa压力下匀浆4次，破碎率接近100，而单独高压匀
31、浆，同样条件下破碎率为32。 机械破碎前预先用硫醇培养酵母细胞，可以大大提高胞内蛋白的收率。（糖苷酶被激活，细胞壁中的糖被除去，使细胞壁的强度降低）,67,2）与上游过程结合,这里的上游是指菌种选育，基因工程菌构建，细胞培养和发酵过程。在生物技术产业化过程中发现生物技术产品的分离纯化已成为产业化的瓶颈，开始从上游入手寻找解决产品分离纯化的新途径。,68,2）与上游过程结合,避开细胞破碎工艺多数生物产品聚集在细胞内，破碎细胞必不可少。如能使之外泌，就不需细胞破碎。利用基因工程将目的基因与适当的信号肽引导序列融合，克隆到具有运转系统的宿主中，可以达到目的产物分泌到细胞外的目的。在蛋白质和多肽药物生
32、产上已获成功。不仅省细胞破碎工艺，也简化了后处理工艺。 将具有融菌作用的葡聚糖酶基因导入宿主，或利用基因工程技术破坏酿酒酵母的与细胞壁形成有关的KNR4基因，使重组细胞的通透性明显提高，可用于进行胞外蛋白质的生产。,69,2）与上游过程结合,细胞自溶为了省略细胞破碎工艺，采用基因修饰法，控制细胞溶解。如质粒EclE1的自杀基因Kil的基因产物可使细胞完全溶解。在基因表达产物充分积累后，用IPTG诱导，Kil基因在乳糖启动子的控制下，使细胞自溶。同样，使用PL启动子控制下的噬菌体174的溶解基因E，在对温度敏感的阻遏物存在下，将温度提高到40可诱导细胞自溶，使胞内含物释放，可以完全省去细胞破碎。
33、,70,2）与上游过程结合,耐高温产品的基因表达利用蛋白质工程和基因工程使基因产品具有耐高温的特性，在破碎细胞过程中，不必使用低温冷冻系统，可以节省可观的能耗，降低成本；同时其它杂蛋白因受热变性，这可简化后序的分离纯化工艺。,71,2）与上游过程结合,控制发酵和细胞培养条件细胞膜壁的结构和组成与细胞培养的条件，如培养基组成、生长期、pH、温度、溶氧、搅拌等有着密切关系，控制适当条件即可控制细胞耐受破碎的能力。该法在理论上讲比较容易，在实际使用上比较困难，需要做大量的探索工作。,72,3）与下游过程结合,细胞破碎与固液分离紧密相关，在细胞破碎的同时要考虑产生的细胞碎片对后续纯化工艺的影响。产生的
34、可溶性碎片必须除净（造成层析柱和超滤膜的堵塞，缩短设备寿命）。 考虑细胞破碎，要进行整体优化，采用最佳的工艺。如多次高压匀浆，可以增加产物的释放量，但经碎片的逐级破碎，产生细小的碎片，对后续的固液分离增加难度。,73,4 包涵体的分离与纯化,基因工程菌培养液不同表达形式的前处理 胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化 胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,74,外源蛋白质在大肠杆菌中高效
35、表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体(aggregation)又称包涵体(inclusion body)以包涵体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构(天然结构),它们在水溶液中通常不溶解且没有活性,包含体必须经过变性、复性才能获得生物学功能,4.1什么是包涵体,75,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,76,4.2包涵体的形成,77,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 高表达产生的积聚物在细胞
36、内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； 蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； 表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。,4.2包涵体的形成,78,4.2包涵体的形成,包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率(如图3.8所示)。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。 重组蛋白分子内及分子间二硫键的错配 由于重组蛋白在大肠杆菌中表达时,缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子
37、,如折叠酶和分子伴侣等,是包涵体形成的又一原因。,79,4.2包涵体的形成,包涵体形成对重组蛋白的生产的优势: 包涵体具有高密度,易于分离纯化; 重组蛋白以包涵体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解; 对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白时,包涵体形成无疑是最佳选择,80,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白变性溶解,目标蛋白的提纯,包涵体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,目标蛋白的复性,8
38、1,包涵体获得的工艺路线(一),机械破碎 (高压匀浆）,离心提取包涵体,加变性剂溶解,除变性剂复性,82,特点:是利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，再对包涵体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包涵体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,路线1 的特点,83,包涵体获得的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得包涵体,加变性剂溶解包涵体,除变性剂复性,84,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点
39、是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包涵体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。,路线2 的特点,85,包涵体获得的工艺路线（三）,化学破碎 （加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,86,用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包涵体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,路线三的特点：,87,1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜
40、蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,88,2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如1-2 SDS（已禁用）， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱
41、溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。,89,原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 复性方法： 稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析,3） 目标蛋白的复性,90,蛋白质复性影响因素：变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。,91,r
42、IL-2在E.coli中的低密度发酵过程中以包涵体形式表达： 无活性的包涵体形式（约占菌体重量的20%）。,悬浮破壁,PBS,洗涤,离心,湿菌体,发酵液,干净菌体,包涵体,精纯,原液,破壁液,离心,洗涤、溶解,举例：重组人白介素-2的分离纯化,粗纯,脱盐、稀释复性,全检,92,包涵体的提取 用0.01mol/L PBS-EDTA溶液（rIL-2发酵菌裂解液）将菌体 悬浮后使用APV高压均质机进行破菌，循环破碎3次，压力控 制在500-600bar,然后用GQ145管式离心机连续流离心的方法 收集rIL-2粗包涵体（固体）。,2. 包涵体洗涤 用50mmol/L PBS溶液（rIL-2包涵体洗涤
43、液）对rIL-2粗包涵体进行洗涤，去除匀浆破菌过程产生的细菌碎片，然后用Q75管式离心机连续流离心收集提纯后的包涵体（固体）；,93,3. 包涵体的变性溶解 先用PB-2%SDS溶液（包涵体溶解液）将rIL-2包涵体溶解，然后将溶解液缓缓倒入PB-5.8%氯化钠溶液（包涵体反沉液）中利用盐析的方法对蛋白进行提纯，并用J-26XP型台式高速冷冻离心机离心收集沉淀物，最后将沉淀物再次用PB-2%SDS溶液（包涵体溶解液）进行溶解，并用J-25型台式高速冷冻离心机离心收集上清液，收集的上清即为rIL-2包涵体蛋白溶液，纯度应达到68以上。,94,4. S-200凝胶层析 将包涵体溶液进行Sephac
44、ryl S-200柱层析（10cm120cm，粒径25-75m）室温洗脱，检测器波长为280nm.洗脱液为50mmol/L PB-1SDS（S-200凝胶层析洗脱液）室温下洗脱，收集最高色谱主峰。蛋白纯度可达90%以上。,5、复性 将S-200凝胶层析收集液过Sephadex G-25凝胶柱（20cm40cm, 粒径50-150m），检测器波长为280nm ,洗脱液为50mmol/L PB-0.05SDS(G-25凝胶层析洗脱液)，收集第1色谱峰。 用50mmol/L PB-0.05SDS(G-25凝胶层析洗脱液)将G-25凝胶层析收集液进行稀释，室温搅拌20+2小时，恢复蛋白活性。,96,6. 复性后纯化复性后蛋白 反相层析进行高度分离洗脱液A相：0.1%三氟乙酸的注射用水溶液 洗脱液B相：0.1三氟乙酸的乙腈溶液 以梯度程序洗脱样品， 纯度达96%以上（由SDS-PAGE和RP-HPLC鉴定），蛋白收率大于35%,97,白介素-2包涵体产物分离和蛋白提纯,98,小结,一、细胞壁结构和特点,二、细胞破碎的方法,三、细胞破碎率效果的检验,四、选择破碎方法的依据,五、破碎技术的发展方向,谢谢！,
