1、第六次课 细胞的复苏、细胞周期测定、 真核细胞转染,一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,实验七 细胞的复苏,二、操作步骤 1、准备一个37水浴箱（或一只茶
2、缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37的温水）。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中（预先加有10ml完全培养液），吹打均匀。 4、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。 5、沉淀加适当培养基吹打均匀后，将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况。,流式细胞术（Flow Cytometry简称FCM）是一种快速测定单个细胞物理、化学、生物特性的仪器。商品仪器的测量速度约每秒10003000个细胞，这种技术与现代一系列高技术的发展有密切关系。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、总蛋白、RN
3、A含量、表面抗原、染色体、膜的完整性、DNA合成速率等。已广泛用于细胞学、肿瘤学、遗传学、免疫学、血液学和若干临床的领域中，其应用的范围有不断扩大的趋势。,实验七 细胞周期测定,什么是细胞周期 ？,由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫细胞周期。分为4个期： G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。 S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期。 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。 M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。,Eucaryotic Cell Cycle,A ty
4、pical mammalian cell has a cell cycle time of 24 hours, with 12 hr G1, 6-8 hr S, 3-4 hr G2, and 1 hr M,（一）原理,细胞通过用DNA结合染料进行染色，如PI。DNA图示：能够作出对细胞在细胞周期G1/G2，S和G2/M阶段的产量的评估；不能很好地提供有关细胞通过细胞周期的运动信息；能够较易地进行免疫荧光结合染色。碘化丙锭（Propidium Iodide，简称PI），为核酸嵌入型染料，可嵌入双股螺旋多核苷酸结构，故DNA和RNA均可着色。PI不能穿过活细胞膜，故活细胞拒染；但能穿过死细胞膜，使
5、之着色。,（二）试剂和器材,RNA酶A PI C6细胞 流式细胞仪,（三）操作步骤,1单细胞悬液用计数器计数后，取总数约2106个细胞，用70%冷酒精，在4固定1天。 2离心1500转/分，10分钟，去上清，用PBS冲洗，打散、摇匀。 3再次离心，去上清，留0.2ml左右，加入RNA酶A，每个样品要求加入30005000单位，37孵育30分钟。 4将样品放入冰中，冷却后每个样品加入大约1.5ml的PI（PI浓度为50g/ml，用PBS溶解），再次放入冰中避光染色20分钟。 5染色后的样品在4小时内上机测量，测试结果以DNA直方图表示。 6有计算机软件时，可做进一步的DNA分布分析。,流式细胞仪
6、测定细胞周期分期实验结果,一、原理,将外源性基因(或基因组DNA)采用分子生物学技术人工地导入细胞，观察它在细胞中的表达，研究其生物学特性和功能，这种把基因导入细胞中的技术称为基因转导(gene transfer)或称基因转移，也简称为导入。是研究基因表达、结构和功能的重要研究手段。主要方法有：磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒等病毒介导法等。,实验八 真核细胞转染,脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-1-2，3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dio
7、leoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。,二、实验材料,1、宿主细胞C6（贴壁细胞） 2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、96孔细胞培养板 4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 5、转染级质粒,三、操作步骤,1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到培养板上。（接种密度是34105/ml.）转染时，细胞要达到9095%的融合。 2、溶液1：2
8、5ul 无血清培养基 + 0.5 ul lipofectamine 2000 per well （总体积25 ul）（温育5min） 3、溶液2：X ul 无血清培养基 +0.2 ug 质粒 per well（总体积25 ul） 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入100ul 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37，5的CO2中保温56小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37，5的CO2中4872h检测转染水平。,四、注意事项,1.细胞的状态：有文献说传代不要超过17代
9、。在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度：细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死。 3. 注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。,4.加入无血清培养基后56小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的。5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。,脂质体转染绿色荧光蛋白融合的目标基因表达定位在胞质,pEGFP,pEGFP-Target gene,
