1、,退出,Enzyme Engineering 酶工程,第五章 固定化酶,第一节 概述 第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标 第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及特点 第四节 固定化细胞 第五节 固定化原生质体和辅酶 第六节 酶反应器 第七节 固定化酶（细胞）的应用,酶的缺陷稳定性差分离纯化困难回收困难,1、为什么进行酶的固定化？,第一节 概述,2、什么是固定化酶？,S,E,S,固定化酶：被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，可以反复、连续使用的酶,2、发展历程,1916 发现酶被吸附在骨炭粉上仍具有活性 1953 Grubohofer等将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等结合固定
2、在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，在实验室实现了酶的固定化 1969 日本 固定化氨基酰化酶 国际上固定化酶应用于连续工业化生产的开端 1973 日本 固定化微生物细胞 我国 1970 微生物所、上海生化所开始固定化酶研究,第二节 固定化酶的特点、性质及其 评价指标,一、固定化酶的优缺点 二、固定化酶的性质变化 三、固定化酶的评价指标,一、固定化酶的优缺点,多次使用反应操作方式多样(分批、连续)提高了酶的稳定性 纯化简单、提高产物质量反应过程可以严格控制 较游离酶更适合于多酶反应 降低酶活力大分子底物较困难首次投入成本高多酶反应不及完整菌株,优点：,缺点：,二、固定化酶的性质变化,1、酶活力的变化
3、2、酶稳定性的变化 3、最适温度的变化 4、最适pH的变化 5、米氏常数(Km)的变化,1、酶活力的变化,酶活力降低，专一性改变例：羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%；而对低分子底物苯酞精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80% 原因(1) 空间构象变化(2) 空间位阻(3) 内扩散阻力(4) 半透膜阻挡,作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特异性往往会变化,2、酶稳定性的变化,表现 增加了酶的耐热性氨基酰化酶 70 15min游离 活力丧失DEAE纤维素 60%DEAE葡聚糖 80%增大了酶对有机试剂、抑制
4、剂等的抵抗能力脱乙酰酶 浆果赤霉素 DEAE纤维素 提高51%,2、酶稳定性的变化,减轻了蛋白酶的破坏作用增强对pH的耐受范围青霉素酰化酶 37 16h游离 pH 7.0-9.0固定化 pH 5.5-10.3,2、酶稳定性的变化,原因酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形 酶活力缓慢释放 抑制酶的自降解 阻挡外界不利因素的侵袭,最适温度提高例：壳聚糖固定胰蛋白酶，最适温度为80 ；比固定化前提高30 ,3、最适温度的变化,最适pH、酶活力pH曲线发生偏移带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高，向碱性偏移,4、最适pH的变化,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,
5、-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,H+,+,+,+,+,+,H+,H+,H+,+,-,OH-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,OH-,OH-,OH-,表观Km随载体的带电性能变化电中性载体，Km ；载体与底物电荷性质相反，Km ；相同，Km,5、米氏常数(Km)的变化,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,S+,S+,S+,S+,S+,S+,三、固定化酶的评价指标,1、固定化酶的活力 每（毫克）干重固
6、定化酶每分钟转化底物(或生成产物)的量，mol min-1 mg-1 单位面积（cm2）的反应初速度表示，mol min-1 cm-2 （酶膜、酶管、酶板）须注明：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、固定化的原酶含量或蛋白质含量、原酶的比活力测定方法：间歇测定；连续测定,三、固定化酶的评价指标,2、蛋白质含量3、操作半衰期 衡量稳定性的指标 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）t1/2 0.693 / KD衰减常数： ， 是时间t后酶活力残留的百分数,三、固定化酶的评价指标,4、 或称偶联效率，酶的固定化率。5、活力保留百分数。6、,第二节结束,第二节结束,点击
7、返回,第三节 固定化酶的制备原则、固定化方 法及特点,一、 固定化酶的制备原则 二、 固定化酶的制备方法及特点,尽可能地保持自然酶的催化活性和专一性 载体与酶结合牢固；不能与底物、产物等 发生化学反应；且具有一定的机械强度 空间位阻较小 成本尽可能低,一、固定化酶的制备原则,1、 一般方法及特点 2、 各种固定化方法的比较 3、 固定化后酶的考察项目,二、固定化酶的制备方法及特点,1、 一般方法及特点,关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进四大类方法(1)吸附法（包括电吸附法）(2)结合法（无机多孔材料）(3)交联法（双功能试剂）(4)包埋法（微胶囊法）,(1) 吸附法,
8、物理吸附法。利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上 载体无机：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、活性炭、微孔玻璃、多孔玻璃等有机：纤维素、胶原、火棉胶、树脂、陶瓷等 载体选择原则a. 要有巨大的比表面积；b. 要有活泼的表面；c. 结合牢固； d. 便于装柱进行连续反应 酶活性中性不易被破坏，高级结构变化少，酶活损失少 酶与载体相互作用力弱，酶容易脱落,(2) 结合法,离子键结合法 共价键结合法,离子键结合法,通过离子键使酶与载体结合的固定化方法，也称离子交换吸附法载体DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CMC-纤维素等 使用时注意pH、离子强度、温度等的控制操作简单，处理条件温和，酶的
9、高级结构和活性中心不易被破坏，酶活回收率高载体和酶结合力弱，易受缓冲液种类和pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往从载体上脱落,共价键结合法,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定化方法 目前应用和报道最多的一类方法参与共价结合的酶的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则往往会造成固定后的酶的活力完全丧失可以形成共价键的基团 游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、甲硫基、吲哚基、二硫键,共价键结合法,常用载体天然高分子衍生物(纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等)人工合成高聚物(聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯、尼龙、聚苯乙烯等)无机载体(多孔玻璃、陶瓷等)
10、通常情况下，载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有直接反应的能力。活化载体有关基因载体接一个双功能试剂,共价键结合法,共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体上引进活泼基团 关键 活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键,共价键结合法,载体活化方法A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D硅烷化法 E溴化氰法,共价键结合法,共价键结合法的特点优点： 酶与载体结合牢固，稳定性好。一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，有利于连续使用。 缺点： 反应条件苛刻，操作复杂；可能引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，往往得不到比活力高的固定化酶。,(3) 交联法,借助双
11、功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。应用最广泛的是戊二醛,方法 酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡酶辅助蛋白交联：使用辅助蛋白(白蛋白、明胶、血红蛋白等)来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联可避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活,(3) 交联法,（无载体固定化）,（共交联法）,双重固定法 通过酶分子间交联形成的固定化酶颗粒一般很小，而且机械性能不是很好吸附交联法
12、交联包埋法,(3) 交联法,(4) 包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法常用载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等分类：网格型和微囊型 网格型 微囊型,(4) 包埋法, 网格型将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法,(4) 包埋法, 微囊型是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法,(4) 包埋法, 微囊型微囊化法制备固定化酶的方法界面沉淀法：物理方法，利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成
13、的皮膜将酶包埋界面聚合法：化学方法，利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来,2、各类固定化方法的特点比较,3、固定化后酶的考察项目,（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率 （2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件,第三节提要,思考题I,什么是固定化酶？与游离酶相比，固定化酶有哪些优缺点？ 制备固定化酶，需遵循哪些原则？固定化后，需考察哪些项目？ 简述酶固定化后，其稳定性得以提高的原因。 试述酶进行固定化之后，酶的性质将有何变化？ 简述固定化酶制备的一般方法、基本原理以及各自的优缺点。 试述共价键结合法制备固定化酶的一般“通式”，及共价结合法的
14、优缺点。,第三节结束,点击返回,第五章 固定化酶,第一节 概述 第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标 第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及特点 第四节 固定化细胞 第五节 固定化原生质体和辅酶 第六节 酶反应器 第七节 固定化酶（细胞）的应用,第四节 固定化细胞,一、固定化细胞的概念和目的 二、固定化细胞的特点 三、固定化细胞的分类 四、细胞固定化方法及特点,一、固定化细胞的概念和目的,概念 细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力 目的 生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶的发酵生产。具产酶率
15、高、发酵周期短、可连续发酵等优点,细胞特性比较,微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞,二、固定化细胞的特点,优点省去了酶的分离过程，降低生产成本 固定化细胞为多酶系统，无需辅因子再生 对不利环境耐受性增加，细胞可重复使用，简化了细胞培养过程 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性,二、固定化细胞的特点,缺陷只适用于胞外酶，不适于胞内酶 多种酶存在，形成较多副产物 使用初期会有一些细胞组分渗出，影响产物质量 有些细胞在条件不适宜的情况下易发生自溶,三、固定化细胞的分类,细胞类型固定化微生物细胞固定化植物细胞固定化动物细胞形状颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状,三、固定化细胞
16、的分类,生理状态固定化死细胞固定化之前或之后细胞灭活处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副产物。比较适合于单酶催化反应固定化活细胞(生长细胞、增殖细胞)将活细胞固定在载体上，并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力固定化静止细胞(饥饿细胞)固定化后细胞是活的，但细胞并不生长繁殖，处于休眠状态或饥饿状态,四、细胞固定化方法及特点,1、直接固定法 2、吸附法 3、包埋法 4、交联和共价偶联法,1、直接固定法,不使用载体，借助物理、化学方法将细胞直接固定eg. 微生物细胞：加热、冰冻、-射线柠檬酸、絮凝剂、交联剂、变性剂 作用使菌体内起破坏作用的蛋白酶等变性，防止目的酶蛋白被水解 使细胞结构
17、固定，避免目的酶的泄漏 使菌体聚集，避免酶的流失，促进较大的菌体颗粒形成 适用范围 一般只能用于单酶或少数几种酶的催化反应,2、吸附法,定义通过载体与细胞间的静电引力使细胞固定吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等 影响因素 表面电荷密度的大小 电荷性质 载体的性质,2、吸附法,条件温和，方法简单，可再生稳定性差 适用范围制备固定化动物细胞的主要方法 固定化植物细胞因成本高、难以大规模生产而受限,3、包埋法,包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法 优点 操作简单 包埋条件温和 能较好的保持细胞
18、内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产 适用范围：固定活细胞、增殖细胞。主要利用菌体的单种酶或极少数几种酶 方法种类：凝胶包埋法；半透膜包埋法,3、包埋法,凝胶包埋法 载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺等 举例(1) 琼脂凝胶包埋法(2) 海藻酸钙包埋法,4、交联和共价偶联法,交联剂和共价偶联试剂对细胞的毒性较大，应用交联法和共价偶联法固定化细胞的报道较少操作稳定性高在温和条件下进行 开发新的温和的功能试剂及偶联试剂,第四节提要,第四节结束,点击返回,第五节 固定化原生质体和辅酶,一、固定化原生质体 二、固定化辅酶,一、固定化原生质体,原生质体的制备,一、固定化原生
19、质体,原生质体的固定化方法凝胶包埋法 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树脂等 方法同细胞的固定化,一、固定化原生质体,固定化原生质体的特点增加细胞膜透性，利于氧气和营养物质的传递和吸收，以及胞内物质分泌，提高产率 操作与保存稳定性好 利于产物的分离纯化 需添加渗透压稳定剂,二、固定化辅酶,原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生,二、固定化辅酶,方法(1) 辅基的固定化共价偶联法。琼脂糖、纤维素、玻璃珠、高分子合成载体等 (2) 辅酶的固定化溴化氰法、碳二亚胺
20、法以及重氮偶联法等共价偶联；或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中琼脂糖、纤维素、合成高分子、微孔玻璃、水溶性葡聚糖、聚氨基酸等 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍,(2) 辅酶的固定化,辅酶固定化的形式,第五节 固定化原生质体和辅酶,第五节结束,点击返回,第六节 酶反应器,一、概述 二、酶反应器的类型 三、酶反应器的选择 四、酶反应器的操作,一、概述,酶反应器：利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，它为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物作用：为酶提供适当环境，以达到生物化学转化的目的，使底物生成所需产物特点：低温、低压下作用；不表现自催化方式，即细
21、胞的连续再生,二、酶反应器的类型,分类： 、 、 等,结构,几何形状,操作方式,二、酶反应器的类型,分类： 、几何形状、操作方式等,结构,二、酶反应器的类型,1、搅拌罐式反应器 2、填充床式反应器 3、流化床反应器 4、鼓泡式反应器 5、膜反应器 6、喷射式反应器,1、搅拌罐式反应器,酶催化反应中最常用的反应器 反应罐、搅拌器和保温装置组成 分批搅拌罐式反应器(BSTR)、连续搅拌罐式反应器(CSTR),1、搅拌罐式反应器,特点 酶与底物混合均匀，结构简单 温度、pH易控制，传质阻力低 BSTR可用于流加分批式反应，CSTR只适用于固定化酶 反应效率低，载体易被剪切力破坏 搅拌动力消耗大,2、
22、填充床式反应器,用于固定化酶 固定化酶堆叠在一起，固定不动，底物溶液按一定方向以一定速度流过反应床,2、填充床式反应器,特点 设备简单，操作方便 固定化酶密度大，提高催化反应速度 底层的固定化酶颗粒所受压力大，易变形或破碎,3、流化床反应器,用于固定化酶 固定化酶置于反应器内，底物溶液以一定流速由下而上流过，同时反应液连续排出，酶颗粒在不断悬浮翻动状态下进行催化反应,3、流化床反应器,特点 混和均匀，传质和传热效果好 温度和pH易控制 不易堵塞，黏度较大反应液也可以进行反应 剪切力及碰撞可能使固定化酶颗粒破坏 流体动力学变化大，参数复杂，难于放大,4、鼓泡式反应器,无搅拌装置 利用从反应器底部
23、通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用 三相流化床反应器,4、鼓泡式反应器,特点 结构简单，操作容易，剪切力小 物质与热量传递效率高 有气体参与的酶催化反应中常用的反应器 气体需通过分布器进行分布,5、膜反应器,酶催化反应与半透膜分离作用组合在一起 固定化酶、游离酶,5、膜反应器,5、膜反应器,集反应与分离于一体，利于连续化生产 对于游离酶反应来说，酶可以回收循环使用，特别使用于价格较高的酶 能降低或消除产物抑制作用 使用一段时间后，酶或其它杂质易吸附在膜上，造成膜的透过性降低，而且清洗困难,6、喷射式反应器,利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短
24、时催化反应的一种反应器 游离酶,6、喷射式反应器,特点结构简单，体积小，混合均匀 温度高，反应速度快，催化效率高 只适用于某些耐高温酶的反应,三、酶反应器选择,1、酶的应用形式 2、底物或产物的物理性质 3、酶反应动力学 4、酶的稳定性 5、反应的操作要求 6、反应器应用的可塑性及成本,1、酶的应用形式,游离酶回收困难，只适于分批反应器 颗粒状或片状固定化酶可用连续搅拌罐、填充床反应器 膜状和纤维状固定化酶只适用于填充床反应器 易变形或易凝集粒状酶，或需使用小颗粒酶，采用流化床反应器,2、底物或产物的物理性质,底物或产物分子质量较大时，不采用膜反应器 底物或产物溶解度较低、黏度较高时，选择搅拌
25、罐式反应器，或流化床反应器 底物为气体时，选择鼓泡式反应器 需要小分子物质作辅酶的反应，不采用膜反应器,3、酶反应动力学,酶与底物的混合程度、底物浓度对酶反应速度的影响，反应产物对酶的反馈抑制作用以及酶催化作用的温度条件等eg. 高浓度底物抑制作用的酶反应，如采用分批搅拌罐式反应器，可采取流加分批式反应方式 产物对酶有反馈抑制作用，选用膜反应器,4、酶的稳定性,反应器中酶催化活性损失的原因酶本身失效 酶从载体上脱落 载体肢解 扩散限制效应 CSTR远比其余类型反应器更易引起这类损失,5、反应的操作要求,需不断调整pH、或补充反应物、或经常供氧、或更新酶，可在搅拌罐等反应器中进行 反应耗氧，可选
26、择鼓泡式反应器,6、反应器应用的可塑性及成本,选用的反应器，最好能有多种用途，生产各种产品 酶本身的价值与其在相应的反应器中的稳定性,四、酶反应器的操作,1、酶反应器操作条件的确定及其调控温度、pH、底物浓度、酶浓度、反应液的混合与流动等,四、酶反应器的操作,2、保持酶反应器的操作稳定性温度、pH 搅拌式反应器：搅拌速度的稳定 连续式反应器：流速稳定,四、酶反应器的操作,3、防止酶的变形失活注意温度、pH、金属离子、剪切力等导致酶变形失活,四、酶反应器的操作,4、防止微生物的污染酶反应器不必在严格的无菌条件下操作 需符合必要的卫生条件，避免微生物污染 微生物污染，影响产品质量，消耗底物或产物，
27、产生有害副产物，增加分离纯化的困难 措施 保证生产环境清洁卫生，符合必要的卫生条件 反应器使用前后进行清洗和消毒处理 操作过程中，严格管理，经常检测 添加对酶催化反应和产品质量无不良影响的物质,第六节提要,第六节结束,点击返回,第七节 固定化酶（细胞）的应用,一、在基础理论研究中的应用 二、在工农业生产上的应用 三、在医药治疗上的应用 四、在分析测试中的应用 五、在环境保护中的应用 六、在新能源开发中的应用,一、在基础理论研究中的应用,阐明酶反应机理，揭示酶原激活机理 酶的细胞生物学研究 酶的结构功能研究 酶分子的改造与模拟,酶亚基性质的研究,研究蛋白质-核酸分子结构,连续的固定化酶柱进行DN
28、A序列分析 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列该系统由连续的6个固定化酶柱组成 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，荧光酶柱,二、 在工农业生产上的应用,葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶 固定化木瓜蛋白酶改善啤酒的品质 利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类,三、 在医药治疗上的应用,固定化可延长酶在体内的半衰期、避免免疫反应，使药物酶集中输送到靶组织制造人工肾 利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效,酶传
29、感器 固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管等)密切结合而成的传感装置 应用于临床诊断、工业发酵过程控制、环境检测等领域 酶电极：应用最广泛。由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置,四、 在分析测试中的应用,酶电极,四、 在分析测试中的应用,固定化酶柱检测器包括固定化酶柱和检测器两部分，酶柱和检测器可分离组合，即同一酶柱可和不同的检测器自由组合,五、 在环境保护中的应用,环境监测 污染物处理,六、 在新能源开发中的应用,生物柴油，燃料乙醇利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气,第七节结束,
30、思考题II,在利用共价键结合法进行酶的固定化过程中，载体活化的方法有哪些？ 什么是固定化细胞？与固定化酶相比较，有何优缺点？ 什么是酶反应器？其与化学反应器和发酵罐相比有何区别？ 试比较各类酶反应器的优缺点（按结构分）。 在酶的应用中，如何选择合适的酶反应器？ 在酶反应过程中，如何进行酶反应器的操作？,第七节结束,点击返回,A重氮法,原理 带芳香氨基的水不溶载体的主要反应，载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联，得到固定化酶,A重氮法,载体对氨基苯磺酰乙基(ABSE)纤维素，琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
31、该方法需要载体具有芳香族氨基,B. 叠氮法,适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CMC、葡聚糖、聚氨基酸等 以CMC为例，制备叠氮衍生物固定化胰蛋白酶步骤如下酯化 肼解 叠氮化 偶联,C烷基化反应法,含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶,D硅烷化法,一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷多孔玻璃特点 机械强度好，表面积大 耐有机溶剂和微生物破坏载体可以再生，寿命长,D硅烷化法,D硅烷化法,D硅烷化法,E溴化氰法,本方法主要用溴化氰(CNBr)活化含羟基载体。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖类物质，其中以琼脂糖为载体的占多数(大孔网状结构)用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能,E 溴化氰法,吸附交联法,先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶,交联包埋法,把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好,
