十六种中草药提取物对鳗弧菌体外抑菌作用的研究.pdf

1、第 38卷 第 6期Vol138 No16淡 水 渔 业Freshwater Fisheries2008年 11月Nov12008收 稿 日 期 : 2008 - 06 - 23资 助 项 目 : 淮 海 工 学 院 博 士 启 动 基 金 ( KQ07102)第 一 作 者 简 介 : 苏 振 霞 (1978 - ) , 女 , 讲 师 , 博 士 , 主 要 从 事 海 洋 生 物 与 生 态 学 研 究 。 E2mail: suzhenxia sina. com 研 究 简 报 十 六 种 中 草 药 提 取 物 对 鳗 弧 菌 体 外 抑 菌 作 用 的 研 究苏 振 霞 , 肖 辉

2、, 单 娟 娟 , 薛 强(淮 海 工 学 院 海 洋 生 物 技 术 重 点 建 设 实 验 室 , 江 苏 连 云 港 222005)摘 要 : 研 究 了 十 六 种 中 草 药 对 鳗 弧 菌 (V ibrio anguillarum )的 体 外 抑 菌 作 用 。 结 果 显 示 : 十 六 种 中 草 药 提 取 物 对 鳗弧 菌 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用 , 其 中 大 黄 、 五 倍 子 、 黄 连 的 水 提 物 和 醇 提 物 的 抑 菌 效 果 最 好 , 且 两 种 提 取 物 的M IC值 相 同 , 分 别 为 1195 mg/mL、 0198 mg

3、/mL和 1195 mg/mL。关 键 词 : 中 草 药 ; 鳗 弧 菌 (V ibrio anguillarum ) ; 抑 菌 圈 ; 最 小 抑 菌 浓 度 ; 最 小 杀 菌 浓 度中 图 分 类 号 : S963; S85813151 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1000269072(2008) 0620073203Study on Bacter iosta sis in V itro of 16 K inds of Ch ineseHerba l M ed ic ines on V ibrio angu illa rumSU Zhen2xia, X IAO H

4、ui, SHAN Juan2juan, XUE Q iang(J iangsu Key Laboratory of M arine B iotechnology, Huaihai Institute of Technology, L ianyungang, J iangsu 222005)Abstract: Bacteriostasis in vitro of 16 kinds of Chinese herbal medicine was studied in this experiment. The resultsshowed that 16 kinds of Chinese herbal

5、medicine extracts had inhibitory effect on V ibrio anguillarum to different degree,the water and ethanol extracts of Rhubarb, Gallnut, Huanglian had better inhibitory effect and the same M IC, which were1195 mg/mL, 0198 mg/mL and 1195 mg/mL, respectively.Key words: Chinese herbal medicine; V ibrio a

6、nguillarum ; inhibitory circle; m inimal inhibitory concentration; m inimalbactericidal concentration鳗 弧 菌 (V ibrio anguillarum )可 以 侵 染 大 多 数 海水 鱼 , 是 对 海 水 养 殖 鱼 类 危 害 最 大 的 弧 菌 。 目 前 报道 至 少 有 40多 种 鱼 可 被 鳗 弧 菌 感 染 , 其 中 重 要 的养 殖 品 种 有 鲑 、 虹 鳟 、 鳗 鲡 、 香 鱼 、 鲈 、 鳕 、 大 菱鲆 、 牙 鲆 、 黄 鱼 等 1 。 由 鳗 弧 菌 引

7、 起 的 细 菌 性 败血 症 是 近 年 来 在 我 国 流 行 范 围 广 、 感 染 鱼 类 多 、 死亡 率 高 、 危 害 损 失 大 的 养 殖 鱼 类 急 性 传 染 性 疾 病 ,每 年 给 水 产 养 殖 业 造 成 巨 大 的 经 济 损 失 2 。 中 草药 是 天 然 药 物 , 因 其 无 抗 药 性 、 无 残 留 、 无 副 作用 、 无 环 境 污 染 、 不 引 发 药 源 性 疾 病 及 抑 菌 杀 菌 效果 明 显 而 备 受 人 们 关 注 3 5 。 本 实 验 测 定 了 五 倍 子等 16种 中 草 药 对 鳗 弧 菌 的 体 外 抑 菌 作 用

8、, 从 中 筛选 出 对 鳗 弧 菌 有 较 好 体 外 抑 制 作 用 的 中 草 药 , 旨 在为 该 菌 引 起 的 暴 发 性 鱼 病 的 防 治 提 供 参 考 。1 材 料 及 方 法111 实 验 材 料实 验 用 鳗 弧 菌 由 淮 海 工 学 院 海 洋 学 院 微 生 物 学实 验 室 提 供 。牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 : 每 1000 mL培 养 基 含 牛肉 膏 310 g、 蛋 白 胨 1010 g、 氯 化 钠 510 g、 琼 脂 20 g。实 验 中 所 用 的 十 六 种 中 草 药 为 : 黄 连 、 金 银花 、 鱼 腥 草 、 连 翘 、 诃

9、 子 、 大 青 叶 、 夏 枯 草 、 蒲 公英 、 苦 参 、 白 头 翁 、 黄 芪 、 大 黄 、 天 南 星 、 黄 柏 、五 倍 子 和 板 蓝 根 。 所 有 中 草 药 均 购 自 连 云 港 市 中 医药 研 究 所 。112 实 验 方 法11211 药 液 制 备将 十 六 种 中 草 药 分 别 用 粉 碎 机 粉 碎 , 分 装 到 广口 瓶 中 待 用 。 为 了 探 讨 不 同 中 草 药 提 取 方 法 对 鳗 弧菌 的 抑 菌 效 果 , 本 实 验 采 用 煎 煮 法 和 乙 醇 蒸 馏 法 两种 提 取 方 法 。煎 煮 法 : 将 供 试 中 草 药 各

10、 取 30 g倒 入 烧 杯 中 ,加 400 mL水 , 浸 泡 30 m in后 煎 煮 。 边 煮 边 搅 拌 ,煮 沸 后 火 煮 30 m in, 滤 出 药 液 , 共 煎 3次 , 合 并所 得 药 液 , 浓 缩 至 生 药 含 量 为 1000 mg/mL。 抽 滤除 菌 后 置 于 4 冰 箱 中 保 存 待 用 6 。乙 醇 蒸 馏 法 : 上 述 中 草 药 各 取 30 g倒 入 圆 底烧 瓶 中 , 加 50%的 乙 醇 , 加 入 量 以 浸 过 药 材 表 面 1 2 cm 为 宜 , 回 流 提 取 60 m in, 待 冷 却 后 过 滤 。于 药 渣 中

11、加 入 乙 醇 , 作 第 二 次 回 流 , 约 半 小 时 。 收集 2次 的 滤 液 , 浓 缩 至 生 药 含 量 为 1000 mg/mL,抽 滤 除 菌 后 置 于 4 冰 箱 中 保 存 待 用 6 。11212 菌 悬 液 制 备在 三 角 烧 瓶 中 倒 入 少 量 的 液 体 培 养 基 , 接 种 鳗弧 菌 后 震 荡 培 养 12 16 h。 将 培 养 好 的 菌 液 用 液 体培 养 基 稀 释 到 合 适 浓 度 。 本 实 验 的 菌 液 浓 度 为 312 107 个 /mL。11213 抑 菌 圈 的 测 定固 体 培 养 基 平 板 内 倒 入 10 mL

12、培 养 基 , 厚 度 约3160 mm, 每 种 药 液 设 3个 平 板 。 分 别 向 平 板 上 加100 L菌 液 , 涂 抹 均 匀 。 然 后 用 打 孔 器 (直 径 为5100 mm)在 每 个 平 板 上 打 3个 孔 , 做 好 药 物 标 记 。每 孔 加 入 30 L药 液 。 将 平 板 置 于 28 培 养 箱 中培 养 24 h。 观 察 并 用 游 标 卡 尺 测 量 抑 菌 圈 。 抑 菌 效果 判 定 参 照 文 献 7 : 抑 菌 直 径 = 20 mm为 极 敏 ,用 “ + ” 表 示 ; 15 19 mm为 高 敏 , 用 “ + ”表 示 ; 1

13、0 14 mm 为 “ 中 敏 ” , 用 “ + ” 表 示 ;10 mm以 下 为 低 敏 , 用 “ - ” 表 示 。11214 最 小 抑 菌 浓 度 (M IC)的 测 定根 据 琼 脂 扩 散 法 的 结 果 , 选 取 抑 菌 圈 直 径 =15100 mm的 中 草 药 测 定 其 对 鳗 弧 菌 的 最 小 抑 菌 浓度 (M IC)。最 小 抑 菌 浓 度 (M IC)的 测 定 采 用 双 倍 试 管 稀 释法 8 : 将 每 种 中 草 药 作 为 一 组 , 每 组 取 13支 无 菌试 管 (其 中 两 支 作 为 对 照 )并 编 号 , 向 前 11支 管 各

14、加 入 液 体 培 养 基 2 mL, 再 用 移 液 枪 向 1号 管 加 入1000 mg/mL 的 药 液 2 mL, 充 分 混 匀 后 , 更 换 枪头 , 从 1号 管 中 取 出 2 mL放 入 2号 管 , 以 此 类 推 ,然 后 从 11号 管 中 吸 出 2 mL丢 弃 , 再 向 前 11支 管各 加 入 菌 液 20 L。 最 后 向 对 照 管 1加 入 2 mL液体 培 养 基 , 向 对 照 管 2加 入 2 mL 液 体 培 养 基 和20 L菌 液 。 置 于 28 培 养 箱 中 培 养 24 h, 然 后取 出 观 察 。 凡 是 药 物 最 高 稀 释

15、 管 中 无 细 菌 生 长 者 ,该 管 的 浓 度 即 为 该 种 药 物 对 该 菌 的 最 小 抑 菌 浓 度(M inimal Inhibitory Concentration, 简 称 M IC )。 水提 物 和 醇 提 物 各 重 复 一 次 。11215 最 小 杀 菌 浓 度 (MBC)的 测 定在 M IC实 验 基 础 上 从 无 明 显 细 菌 生 长 的 各 管取 材 分 别 涂 布 于 相 应 的 无 菌 琼 脂 平 板 培 养 基 , 于28 的 恒 温 培 养 箱 培 养 24 48 h, 观 察 结 果 。 琼脂 平 板 上 无 细 菌 生 长 且 含 药

16、液 最 少 一 管 的 药 液 浓度 , 即 为 该 种 药 物 对 该 菌 的 最 低 杀 菌 浓 度 (M inimalBactericidal Concentration, 简 称 MBC)。2 结 果211 中 草 药 水 提 物 的 抑 菌 圈 大 小中 草 药 水 提 物 的 抑 菌 圈 大 小 如 表 1所 示 , 不 同中 草 药 具 有 不 同 程 度 的 抑 菌 活 性 。 结 果 显 示 鳗 弧 菌对 十 六 种 中 草 药 极 为 敏 感 的 有 黄 连 、 五 倍 子 、 诃子 、 大 黄 4种 , 抑 菌 圈 非 常 明 显 ; 高 度 敏 感 的 有 黄柏 1种

17、; 中 度 敏 感 的 有 大 青 叶 、 白 头 翁 、 连 翘 、 夏枯 草 、 金 银 花 、 板 蓝 根 6种 ; 低 度 敏 感 的 有 苦 参 、黄 芪 、 蒲 公 英 、 鱼 腥 草 、 天 南 星 5种 , 抑 菌 圈 直 径小 于 10 mm。表 1 十 六 种 中 草 药 水 提 物 对 鳗 弧 菌 的 体 外 抑 菌 圈Tab11 Inh ib itory c ircle of Ch inese herba l m ed ic inewa ter extracts to V1angu illa rum药 品 抑 菌 圈(mm)相 对敏 感性药 品 抑 菌 圈(mm)相 对

18、敏 感性黄 连 31148 2114 + 夏 枯 草 10199 0187 +五 倍 子 25190 0182 + 金 银 花 10173 1131 +诃 子 24160 0173 + 板 蓝 根 10123 1124 +大 黄 23153 1105 + 苦 参 9113 0115 -黄 柏 16118 1127 + 黄 芪 8172 0163 -大 青 叶 13141 1173 + 蒲 公 英 8171 0196 -白 头 翁 11189 0190 + 鱼 腥 草 8147 0182 -连 翘 11104 0140 + 天 南 星 8127 0181 -212 中 草 药 醇 提 物 的 抑

19、 菌 圈 大 小中 草 药 醇 提 物 的 抑 菌 圈 大 小 如 表 2所 示 。 由 表2看 出 , 鳗 弧 菌 对 十 六 种 中 草 药 极 为 敏 感 的 有 黄连 、 五 倍 子 、 诃 子 3种 , 抑 菌 圈 非 常 明 显 ; 高 度 敏感 的 有 大 黄 1种 ; 中 度 敏 感 的 有 黄 柏 、 天 南 星 、 苦参 3种 ; 低 度 敏 感 的 有 板 蓝 根 、 黄 芪 、 夏 枯 草 、 大青 叶 、 金 银 花 、 连 翘 、 蒲 公 英 、 白 头 翁 、 鱼 腥 草9种 , 抑 菌 圈 直 径 小 于 10 mm。47 淡 水 渔 业 2008年表 2 十

20、六 种 中 草 药 醇 提 物 对 鳗 弧 菌 的 体 外 抑 菌 圈Tab12 Inh ib itory c ircle of Ch inese herba l m ed ic ineethanol extracts to V1angu illa rum药 品 抑 菌 圈(mm)相 对敏 感性药 品 抑 菌 圈(mm)相 对敏 感性五 倍 子 26179 1108 + 黄 芪 8184 0138 -黄 连 23146 1105 + 夏 枯 草 8160 0137 -诃 子 21115 1132 + 大 青 叶 8156 0142 -大 黄 17121 0180 + 金 银 花 8100 01

21、47 -黄 柏 13173 1125 + 连 翘 7199 0154 -天 南 星 10181 0142 + 蒲 公 英 7155 0170 -苦 参 10150 0142 + 白 头 翁 7102 0137 -板 蓝 根 9183 0178 - 鱼 腥 草 6172 0122 -213 中 草 药 水 提 物 和 醇 提 物 的 M IC和 M BC根 据 各 种 中 草 药 对 鳗 弧 菌 的 抑 菌 圈 的 大 小 有 选择 性 地 挑 取 抑 菌 圈 直 径 = 15100 mm 的 药 物 进 行M IC和 MBC的 测 定 。 结 果 见 表 3。表 3 十 六 种 中 草 药 水

22、 提 物 、 醇 提 物 对 鳗 弧 菌 的最 小 抑 菌 浓 度 和 最 小 杀 菌 浓 度Tab13 M IC and M BC of Ch inese herba l m ed ic ine wa terextracts and ethanol extracts to V1angu illa rummg/mL药 品 最 小 抑 菌 浓 度 (M IC) 最 小 杀 菌 浓 度 (MBC)水 提 物 醇 提 物 水 提 物 醇 提 物诃 子 31125 31125 125 125大 黄 1195 1195 6215 31125五 倍 子 0198 0198 15163 3191黄 柏 12

23、5 125 250 250黄 连 1195 1195 3191 3191水 提 物 中 以 五 倍 子 为 最 好 , 其 浓 度 达 到0198 mg/mL就 能 抑 制 细 菌 生 长 , 大 黄 和 黄 连 次 之 ,其 M IC均 为 1195 mg/mL; 杀 菌 浓 度 最 小 的 为 黄连 , 其 浓 度 达 到 3191 mg/mL 就 能 杀 灭 鳗 弧 菌 ,其 次 为 五 倍 子 和 大 黄 , 其 浓 度 达 到 15163 mg/mL和 6215 mg/mL时 能 起 到 杀 灭 病 菌 的 作 用 。 诃 子 、大 黄 、 五 倍 子 、 黄 柏 和 黄 连 的 醇

24、 提 物 的 最 小 抑 菌 浓度 与 其 水 提 物 相 一 致 。 但 大 黄 、 五 倍 子 的 醇 提 物 对鳗 弧 菌 的 杀 灭 作 用 好 于 其 水 提 物 。3 讨 论本 实 验 结 果 显 示 , 在 实 验 条 件 相 同 的 情 况 下 ,黄 连 、 五 倍 子 、 诃 子 、 大 黄 对 鳗 弧 菌 表 现 出 较 强 的抑 菌 效 果 , 说 明 这 些 中 草 药 中 含 有 可 以 抑 制 甚 至 杀灭 鳗 弧 菌 的 有 效 成 分 , 从 其 水 提 物 和 醇 提 物 的 效 果对 比 可 见 , 两 种 提 取 物 都 能 有 效 抑 菌 , 因 此 采

25、 用 中草 药 来 防 治 由 鳗 弧 菌 引 起 的 鱼 病 , 是 确 实 可 行 的 ,治 疗 时 应 根 据 中 草 药 的 M IC和 MBC测 定 结 果 , 调节 其 用 药 量 , 使 用 药 后 鱼 体 内 的 药 物 浓 度 达 到 抑 菌浓 度 以 上 。 表 3表 明 , 采 用 水 提 法 和 醇 提 法 得 到 的黄 连 、 五 倍 子 、 诃 子 、 大 黄 的 最 小 抑 菌 浓 度 相 同 ,但 采 用 醇 提 法 可 提 高 大 黄 、 五 倍 子 的 杀 菌 效 果 , 因此 需 进 一 步 采 用 治 疗 实 验 来 分 析 提 取 方 法 是 否 在

26、治疗 鳗 弧 菌 引 发 的 疾 病 方 面 有 差 距 。 姜 新 发 6 报 道大 黄 和 黄 连 的 水 提 物 及 醇 提 物 对 鳗 弧 菌 的 最 小 抑 菌浓 度 相 同 , 与 本 实 验 得 到 的 结 果 相 同 。 张 明 9 报道 五 倍 子 对 鳗 弧 菌 的 最 小 抑 菌 浓 度 和 最 小 杀 菌 浓度 分 别 为 31125 mg/mL和 6125 mg/mL, 大 黄 对 鳗弧 菌 的 最 小 抑 菌 浓 度 和 最 小 杀 菌 浓 度 分 别 为0125 mg/mL和 25 mg/mL, 与 本 实 验 结 果 不 太 一致 , 这 可 能 是 由 于 试

27、 验 手 段 、 条 件 等 不 一 致 的 结果 。 另 外 也 同 所 试 菌 株 毒 力 的 强 弱 及 药 物 的 采 集区 、 采 集 季 节 、 使 用 部 位 、 植 物 年 龄 、 贮 藏 炮 制 方法 有 关 7 。本 实 验 证 实 十 六 种 中 草 药 对 鳗 弧 菌 确 有 不 同 程度 的 抑 菌 作 用 , 其 中 黄 连 、 五 倍 子 、 诃 子 和 大 黄 抑菌 效 果 最 好 , 可 用 于 缓 解 或 治 疗 由 鳗 弧 菌 引 起 的 鱼类 疾 病 。参 考 文 献 : 1 莫 照 兰 . 养 殖 牙 鲆 细 菌 性 疾 病 调 查 及 鳗 弧 菌 致

28、 病 性 研 究 R . 中 国 科 学 院 海 洋 研 究 所 博 士 后 研 究 报 告 , 2001, 1112. 2 杨 少 丽 , 王 印 庚 , 董 树 刚 . 海 水 养 殖 鱼 类 弧 菌 病 的 研 究 进 展 J . 海 洋 水 产 研 究 , 2005, 26 (4) : 75 80. 3 王 文 博 , 汪 建 国 , 李 爱 华 , 等 . 中 草 药 应 用 于 水 产 养 殖 的 研究 概 况 J . 中 国 水 产 , 2006, 7: 60 61. 4 向 枭 , 周 兴 华 . 中 草 药 添 加 剂 在 水 产 养 殖 上 的 应 用 J .粮 食 与 饲

29、 料 工 业 , 2000, 3: 27 29. 5 曹 红 峰 , 黄 文 芳 , 宋 靖 芳 . 中 草 药 防 治 鱼 病 研 究 进 展 J .海 洋 科 学 , 2006, 30 (4) : 83 87. 6 姜 新 发 . 中 草 药 提 取 物 对 水 生 动 物 常 见 病 原 菌 的 体 外 抑 菌 试验 J . 饲 料 工 业 , 2005, 26 (22) : 28 29. 7 曹 红 峰 , 宋 靖 芳 , 李 国 庆 , 等 . 中 草 药 对 嗜 水 气 单 胞 菌 ST2323抑 菌 作 用 的 研 究 J . 中 医 药 导 报 , 2007, 13 ( 5 ) : 86 88. 8 戴 自 英 , 刘 裕 昆 , 汪 复 , 等 . 临 床 抗 菌 药 物 学 M . 北京 : 人 民 卫 生 出 版 社 , 1985. 6 8. 9 张 明 , 王 建 华 , 赵 毅 , 等 . 20味 中 药 对 鳗 弧 菌 的 药 敏 试验 J . 动 物 医 学 进 展 , 2005, 26 (8) : 77 79.57第 6期 苏 振 霞 等 : 十 六 种 中 草 药 提 取 物 对 鳗 弧 菌 体 外 抑 菌 作 用 的 研 究