化学发光法检测肿瘤标志物.pdf

1、http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 化学发光法检测肿瘤标志物 贺艳峰1张家明2郭小英*3朱广华1陆祖宏*3(1东南大学公共卫生学院 南京 210009 2江苏省人民医院河西妇幼保健医院检验科 南京 210036 3东南大学生物科学与医学工程系分子电子学国家重点实验室 南京 210096) 摘 要 肿瘤标志物作为诊断肿瘤的一项重要指标， 其检测对于疾病的治疗与预后具有重要的意义。化学发光法是一种灵敏度非常高的分析方法，现已广泛应用于检测肿瘤标志物的研究中。随着发光试剂与检测仪器的不断进步，化学发光法研究也在不断深入发展，作为检测肿瘤标志物的一种重

2、要方法，将为肿瘤的早期诊断以及愈后的监测发挥更重要的作用。本文从化学发光体系、检测仪器以及高新技术在该领域的应用及产生的影响三个角度，综述了化学发光法用于肿瘤标志物检测的研究进展，对该领域未来的发展进行了展望。 关键词 化学发光 肿瘤标志物 Tumor Markers Detection by Chemiluminescence He Yanfeng1, Zhang Jiaming2, Guo Xiaoying*3, Zhu Guanghua1, Lu Zuhong *3(1College of Public Health, Southeast University, Nanjing 2100

3、09；2Clinical Laboratory, Provincial Center of Women and Childrens Health-Care, Nanjing 210036 3State Key Laboratory for Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210096) Abstract Tumor markers are much important signals in patients diagnosis and prognosis of tumors. Chemiluminescence is an analy

4、tical method of high sensitivity. Nowadays it has been widely used in detecting tumor markers. With the development of chemiluminescent reagents and detectors, it will be an important method of detecting tumor markers, large influences for earlier diagnosis tumors and be a very important method in c

5、linical laboratory. The paper summarized the development of chemiluminescence substrate systems, the detecting instruments, the application and influence of the high technology in this field, and the future prospect as well. Key words Chemiluminescence assay, Tumor marker 肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病， 2002

6、 年世界卫生组织 (WHO)公布全世界每年新增 1000 万癌症病例，目前世界上死亡人数中有 12%死于癌症。因此， WHO 指出及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物 (Tumor marker， TM)作为一项重要指标，在肿瘤早期诊断当中发挥着越来越重要的作用。 TM是由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身、或分泌至血液或其他体液、或因肿瘤组织刺激由宿主细胞产生的而含量明显高于正常参考值的一类物质1。 TM 在肿瘤的治疗监测和预后方面具有一定的应用价值。目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种2，由于大多数情况下体内肿瘤标志物的贺艳峰 男， 27

7、 岁，硕士生，现从事生物分子的化学法分析检测。 *联系人， E-mail: K， 国家自然科学基金 (60121101 和 60223002)及国家 863 高新技术 (2002AA2Z2041 和 2004AA302070)资助项目 2005-05-08 收稿， 2005-06-23 接受 http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 2 含量都非常低，一般的检测方法很难对其进行精确的定量。过去对肿瘤标志物的检测主要用放射免疫分析法3，这种方法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。因此，亟待发展一种新的检测

8、方法对血液中 TM 进行精确的定量分析。化学发光法检测正好适应了这种需要。 1不同化学发光体系在肿瘤标志物检测中的应用 与其它分析方法相比，化学发光法具有检测灵敏度高、线性范围宽、检测仪器简单等诸多优点，既没有前面所述的放射免疫分析法的诸多缺点，又没有荧光免疫分析法实验仪器价格昂贵、需要专业人员进行操作、试剂保存要求严格、容易受到样品中自然荧光的干扰等缺点；与分光光度酶免疫测定法相比，其线性范围更宽4。 早期的化学发光法主要用于对金属元素的测定，上世纪 70 年代末， Halmann 和 Vela5首先把化学发光 (CL)与酶免疫反应结合起来，建立了化学发光酶免疫分析法 (CLIA)。目前，它

9、已成为生命科学研究中的一个重要的分析手段，广泛应用于核酸分析6、蛋白质分析7、免疫分析8、进行基因分析9、发光成像分析10、细胞分析11等方面。如 Xu 等6采用自组装技术将 DNA 探针固定在金电极表面，进行 DNA 互补序列杂交，然后与抗生物素 -碱性磷酸酯酶偶合，利用磷酸酯酶催化底物产生化学发光进行 DNA 片断分析， 线性范围宽达 5 个数量级， 检出限为 15pmol/L。 目前为止化学发光免疫测定在临床上应用主要有两类：一是以鲁米诺 (Luminal, 氨基苯二酰一肼 )及其衍生物12为代表的传统发光试剂，将 ABEI 或吖啶酯标记在抗体上与待测抗原结合；然后，加入催化剂或增敏剂根

10、据发光强度的大小对检测物进行定量；另一是用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶 (ALP)13,14对抗体进行标记，然后加入待测抗原使之结合， HRP 和 ALP 可以催化发光底物 (如 AMPPD 等 )，产生发光信号。前者属于发光试剂直接与检测物反应而发光；而后者则是 HRP 或 ALP 催化发光底物使之分解而产生发光信号。 Sasamoto 等14报道了利用 CLIA法，采用 ALP 标记抗体对血清中 hCG 进行了测定； Xue 等15描述了一种采用 ABEI 标记抗 AFP抗体，在氧化电极的作用下产生电致化学发光，由于抗原与抗体结合后会使发光强度降低，利用此原理对体内的 AFP 进行

11、了检测，检测限达 0.01ng/mL，线性范围为 0.01 30 ng/mL。 NHNHNH2OOOH-NHN-NH2OO氧化剂OH-COO-COO-NH2*+ N2COO-COO-NH2+hluminol图1 鲁米诺参与的化学发光的原理 Fig.1 Principle of chemiluminescence induced by luminol 氨基苯二酰肼类参与的 CL 反应需要催化剂 (如过氧化物酶， POD)的参与， 底物主要是鲁米诺、异鲁米诺衍生物，此类物质价格便宜，基本实现了国产化，是当前在临床应用最广的一类发光试http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第

12、68 卷 w135 3 剂，其发光原理如图 1 所示。章竹君7利用辣根过氧化酶 (HRP)催化 H2O2氧化曙红的反应和 HRP催化 H2O2与发光剂鲁米诺的化学发光反应相耦合， 测定血液中甲胎蛋白的含量， 线性范围为 0.10100ng/mL，该法比 ELISA 法灵敏度高 10 倍，且两法具有较好的相关性。 吖啶酯参与 CL 的这类化学反应不需要催化剂的参与，在过氧化氢的稀碱溶液中即能发光，其原理如图 2 所示。庄惠生等16采用自己设计的一种新的合成吖啶酯的方法，并利用自制的双吖啶发光标识物1710,10-二甲基 3,3-二磺酸基 -9,9-双吖啶 (简称 DMDSBA)标识抗癌胚抗原 (

13、CEA)抗体，成功地对 CEA 进行了检测，线性范围为 1.0 150.0ng/mL，检测限为 0.53ng/mL，结果与放射免疫法相关性良好，相关系数为 0.9958。刘农乐8利用吖啶酯标记抗体检测正常女性、孕妇及膀胱癌病人尿中的人表皮生长因子 (hEGF)的含量，灵敏度可达 2ng/mL，他们发现孕妇尿中的含量明显高于正常女性，膀胱癌患者尿中 hEGF 含量明显低于正常人。 NNCH3CH3OH-H2O2NNCH3CH3OO2N*CH3O+图2 吖啶酯参与的化学发光的原理 Fig.2 Principle of chemiluminescence induced by acridine es

14、ter 碱性磷酸酶 (ALP)参与的 CL 是利用发光底物 AMPPD18在碱性磷酸酶的作用下分解成不稳定的 dioxetane 而发光。 AMPPD 是一种新型的化学发光剂，属二氧杂环丁烷类，性能十分稳定，5下保存的固体 AMPPD 几乎不分解。在溶液中 AMPPD 的磷酸酯键很稳定，非酶催化的水解非常慢，在 0.05mol/L 碳酸缓冲液 (pH=12, 5 )中的分解半衰期为 74y19，几乎无试剂本身的发光背景，是一种近乎理想的发光试剂。 AMPPD 在碱性磷酸酶的催化下分解而发光，原理如图 3 所示， 30min 后发光达到稳定并可持续一周没有明显减弱。这种试剂受到国外知识产权的限制

15、，完全依赖进口，价格较高，但由于该试剂具有其他试剂所没有的优点，因此现在已经被应用于临床一些肿瘤标志物的检测当中。 OOOCH3OPO3碱性磷酸酶PO33+OOOCH3O-O+O-OCH3O*光图3 AMPPD参与的化学发光的原理 Fig.3 Principle of chemiluminescence induced by AMPPD http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 4 从 1982 年第一篇化学发光用于肿瘤标志物检测的文献开始到 2005 年 4 月的 24 年间出现了大量的文献2083，纵观这些文献，化学发光检测肿瘤标志物的研究体现出

16、以下一些特点： (1)化学发光体系不断多样化，新发光体系不断涌现，如 luminol-Ab20，吖啶酯 -H2O2发光体系21， MECLIA22， Ru(bpy)32+-NHS-ECL 体系检测23、 AMPPD-ALP-Ab24， DMDSBA-H2O216化学发光体系等发光体系的出现并成功应用于许多肿瘤标志物的检测中。 早期化学发光法检测肿瘤标志物主要是利用鲁米诺和过氧化物酶系统，如 1982 年 Pronovost 等就利用异鲁米诺 -过氧化物酶发光系统对 AFP25进行了检测， 1986 年 Haggart 等26采用以 Luminol-H2O2-对碘苯酚的增强化学发光酶免疫法，对

17、CEA 进行了检测。目前利用化学发光法检测肿瘤标志物的研究虽然大多停留在对一些传统发光试剂的研究上， 但最近有一些科研工作者开始了对一些性能优越的新型发光底物的应用研究，并取得了一些研究成果，已经被广泛应用于脂质、激素、 DNA27、 RNA28、肿瘤标志物的检测中。如曾常茜等29将化学发光免疫测定方法应用于血清 CEA 测定，利用免疫学原理使之形成 ABEI-CEA-McAb 结合物，加入增敏剂和催化剂 Hemin 和 H2O2，最后测定光信号强弱，从而对 CEA 进行定量。最近，许多公司都推出一些高效的发光底物，如 Pierce 公司推出的 Supersignal系列 Western 化学

18、发光底物系统，这些发光底物产品在核酸检测中得到了广泛的应用，其检测限最低可达 10-15g。 Lumigen 公司推出的 Lumigen APS-5 新型化学发光底物可以被 ALP 催化分解产生光信号，其对 ALP 的检测限可达 10-19mol，是一种优良的新型发光底物，它现在已经作为发光探针被用于基因芯片的研究中30；该公司推出的 Lumigen PS-3 也是一种新型的发光底物，它可以被 HRP 催化分解产生发光信号，在免疫检测分析当中得到一定的应用，Stefano 等27已将它应用到检测微小病毒 DNA 的检测当中。 APC 公司推出的 Immulite 系统是利用新型发光底物 AMP

19、PD 可以被 ALP 催化而产生光信号， 目前也已应用于临床检测中。 Amersham公司的 Amerlite 系统利用鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，用 NaOH + H2O2作发光启动试剂，广泛应用于分析检测当中。海底荧光虫素 (cypridina luciferin analogues)也是一种发光效率高、特效性强的试剂，应用于生物样品的检测中31。这些优良的发光试剂由于受国外专利的保护，在国内研究还很少。国产的新型发光底物 SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液是一种新推出的化学发光试剂，也有较高的灵敏度，已在生物样品检测中得到应用。 (2)检测

20、限不断降低。随着优良发光试剂的合成、检测仪器性能的提高，使得化学发光检测限不断的降低。 1982 年 Pronovost 等25利用异鲁米诺 -过氧化物酶发光系统对 AFP 进行检测的灵敏度达 1.9ng/mL。 1996 年 Matsushita 等22利用 MECLIA 法对 CEA 进行检测的检测限达到0.04mg/L，现已应用于临床当中。 2001 年 Hoon 等32直接利用 RT-PCR/ECL 法检测神经节苷酯GM2/GD2 合成酶 Mrna 的变化，其检测限达到 100pg。 2003 年 Wascher 等33还将化学发光法应用于肿瘤细胞骨髓微转移的研究，已可以在 107PB

21、Ls 中检测到 1 5 个肿瘤细胞，逐渐向单个细胞检测方向发展，检测限的降低可大大提高肿瘤诊断的准确性。 (3)不同检测方法之间联用技术的出现。现在的分析方法已经由过去单一检测技术的使用向多种分析手段联用的方向发展，这样可以综合不同分析方法的优点，使检测结果更加真实可靠。化学发光以其高灵敏性已与多种分析方法相联用， 其最早与免疫学方法结合使化学发光法广泛的应用于生物样品的检测当中。 最近不断有化学发光法与其他检测手段联用的方法出现， 如 Cheunghttp:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 5 等34将化学发光法与 PCR 方法相联用对酪氨酸羟化酶、

22、 GAGE、 MAGE 的检测；化学发光与流动注射方法联用应用于 HCG 的检测中；与毛细管电泳联用用于生物芯片的检测中35。 (4)检测特异性不断提高，肿瘤诊断研究不断向深入发展。过去主要是对单个肿瘤标志物检测，由于交叉反应与标志物特异性存在一定的差异，因此在实际应用中受到了限制。近年来，人们通过多种 TM 同时检测，联合应用以期达到准确诊断肿瘤的目的。如吴广平等36利用 CLIA 法对胸水中 CEA、 CA125、 CA153 及 CA199 进行了检测，并认为用对 CEA 与 CA199 的联合检测可使肺癌诊断的敏感性和特异性高达 96.2%和 96.0%。从肿瘤诊断的角度而言，肿瘤标志

23、物的数量检测并不能完全反映出肿瘤发展的阶段。近年来化学发光检测法肿瘤已由早期停留在如 AFP、CEA、 PSA、 TPA 等的数量检测向研究肿瘤细胞发展。如 2003 年 Mutlu 等37利用双抗体夹心法检测膀胱肿瘤纤维连接蛋白； Bhuiyan 等38利用化学发光法检测红细胞，与血色素检测结合对膀胱肿瘤进行研究。 Wascher 等33将化学发光法应用于肿瘤细胞骨髓微转移的研究，他们利用RT-PCR/ECL 法检测 Stc-1 mRNA 在血液与骨髓中的表达以确定乳腺肿瘤细胞的血液、骨髓微转移，采用该方法为肿瘤转移的早期发现提供了一种很好的检测手段。 经过 20 多年的发展，化学发光法检测

24、肿瘤标志物的研究在全世界各国已被扩展到各种肿瘤的检测。 化学发光酶免疫法的发展使许多肿瘤标志物的检测成为可能， 如 CA19939， CA12539,40，PSA20， PSA-1-抗糜蛋白酶复合物20， 1-抗糜蛋白酶20， c-erbB-241， TPA42， EGF8，铁蛋白43， PSA-NCAM44， P5345， hCG46， CA27.2921， CA15.347， MUC148， BR-MA49， OM-MA51，GI-MA52， DCP50， CYFRA21-123， CD4451， CA72-452， AGP52,53， GD2 合成酶54，神经节苷酯 GM2/GD2 合成

25、酶 mRNA32，酪氨酸羟化酶34， GAGE34， MAGE34， MAGE-A mRNA55，MIA 和 S100 betaS-100B 蛋白56， VEGF57， CD1858，胸腺嘧啶脱氧核苷酸激酶59，90K/MAC-2BP60， 膀胱肿瘤纤维连接蛋白37， Stc-1 mRNA33， CYFRA 21-161， 血清 periostin62，甲状腺球蛋白 mRNA63等数十种肿瘤标志物都已成功地用化学发光法进行了检测，并取得了令人满意的结果，有些已经仪器化，并在临床中得到应用。 Berger 等64在对胰腺癌细胞当中的 Ras癌基因的突变是否会引起 Raf-1 的活性变化以及 Ra

26、f-1 与胰腺癌的关系的研究中，分别选取 7 个存在 Ras 癌基因突变细胞与没有突变的胰腺癌细胞之间的种系， 用免疫斑点技术与增强化学发光法对细胞中的 Raf-1 水平进行了检测， 发现两者之间 Raf-1 的表达水平没有显著的差异。 Lin 等65综述了化学发光在肿瘤标志物检测中的应用，认为化学发光在临床肿瘤标志物检测、微型、半自动化和便携式的免疫传感器的研制中具有广阔的应用前景。 2不同分析仪器在化学发光检测肿瘤标志物中的应用 各种化学发光分析仪的问世，不断推动化学发光分析法的普及应用。国外的化学发光分析仪性能优良，检测精密度高，目前已在我国大医院中得到广泛的应用。如美国贝克曼库尔特公司

27、推出的 ACCESS全自动微粒子化学发光免疫分析系统， 它采用 AMPPD-ALP 微粒子化学发光系统，以微粒子 (0.7)作载体 ,表面积大、结合快、达到最大发光信号时间短、反应及分离速度快，缩短了分析时间 ,有效提高了灵敏度和准确性。该系统可全自动控制整个测定和数据分析处理过程，具有批量和任选测定 24 个项目的能力和急诊插入功能， 平均检测速度为 100/h， 且不污染不浪费，操作界面设计十分人性化，用户可申请 Internet 全球通讯网络，进行通讯查询。外形设计智能化，http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 6 使其从外观到内在品质，给人

28、们留下深刻的印象8486。而由美国雅培公司生产的 AxSYM 全自动免疫发光分析仪则将三种技术集于一机，可用于非均相标记微粒子酶免疫发光分析 (MEIA)、离子捕捉发光分析 (ICIA)和均相标记荧光偏振免疫发光分析 (FPIA)， 目前已有 83 个检测项目可供临床应用36。美国拜耳公司最新诊断产品 ACS:180 系列全自动化学发光免疫分析系统87以吖啶酯作为标记，测量 AE 标记物化学反应所产生的光量，灵敏度可达 10 15pg/mL。该系统采用顺磁性微粒作为固相载体，反应物形成类均相悬浮溶液，有效增大反应面积，加速免疫反应，便于自动洗涤、快速分离，方法中不用酶和催化试剂，避免了许多影响

29、因素，只需改变 pH 即可发生发光反应， AE 试剂稳定，有效期长达一年。 我国也自行研制了一些化学发光分析仪，它们与国外同种类型仪器相比价格十分低廉，适合在我国中小医院推广应用。如中国科学院生物物理研究所研制开发的微弱发光测定仪BPCL(-1-KGC)，已应用于进行一些化学发光酶免疫测定，可以对临床中一些常规的指标进行检测，可成为临床样本检测分析的一种重要手段，王永宁等88就利用 BPCL(-1-KGC)微弱发光仪对血清中TSA 进行了检测。福州大学化学系研制的 FG83-1 型化学发光仪也已被应用于检测 CEA 的水平16。 3高新技术在化学发光法检测肿瘤标志物中的应用 1974 年丹麦科

30、学家 Ruzika 和 Hansen88提出的流动注射分析 (Flow injection immunoassay，FIIA)使普通分析和检验的操作及观念发生了根本的转变。 FIIA 的原理如图 4 所示。这种技术与化学发光法的结合使化学发光检测实现了管道化、连续化，促进了化学发光检测法的自动化与在线检测能力。其特点是分析速度快，一般分析速度可达 100 200 份 /h；精密度高，相对标准偏差为 1%左右；操作简便，分析和检测中常用的操作均在管道体系中自动完成；设备简单，检验人员可自行组装系统；节省试样与试剂，试样量可减少至数微升或数十微升，试剂量也可减少至数十微升；适用范围广，可用于多种化

31、学反应和多种检测手段90。它大大地改善了传统方法步骤繁琐，费时费力的缺点，已被广泛的应用于食品、环境、药品及临床检测等方面， Lin 等91将流动注射技术与化学发光免疫检测方法结合用以检测 CEA，取得了令人满意的结果，其线性范围达 1.0 25ng/mL，检测限为 0.5ng/mL，每个样品除去温育 25min 外，检测时间为 5min。该方法与放射免疫法比较具有较好的相关性，相关系数为 0.997； Lin 等92将化学发光酶免疫法与流动注射技术相结合，利用磷酸氢化可地松与碱性磷酸酶反应生成氢化可地松，后者与光泽精反应而产生发光信号，从而达到检测碱性磷酸酶的目的，线性范围为 410-12

32、510-11mol/L，检测限为 110-12mol/L；把 ALP 标记在抗体上，可以达到对某些抗原的检测，并将该检测方法应用于图4 流动注射原理示意图 Fig.4 Principle schematic diagram of flow injection http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 7 对 17-OPH 和绒毛膜促性腺激素 (hCG)的检测中，其中 hCG 的检测范围为 0.6 40mIU/mL，检测限为 0.3mIU/mL；该方法与时间分辨荧光免疫检测法与 AIA 法比较具有良好的相关性，相关系数为 0.970。 上世纪 80 年

33、代末诞生的纳米技术给几乎所有的研究领域带来了新的活力，化学发光法检测肿瘤标志物也不例外。现在普遍使用的 CLIA 多采用微板式或其它基质对抗体进行包覆，往往比较耗时；近年来，有人将化学发光与纳米技术相结合，提出了化学发光磁酶免疫分析法 (Magnetic Enzyme Chemiluminescence Immunoassay, MECLIA)，该方法将磁性分离技术、免疫学方法与化学发光检测技术三者相结合，大大节省了抗体包覆的复杂过程，简化了操作，节省了时间。如图5 所示，铁氧化物纳米颗粒 (如 Fe2O3、 Fe3O4)与常规磁珠相比表面积大大增加，且具有超顺磁性 (可避免外磁场撤去后粒子剩

34、磁形成的颗粒团聚 )，表面连有可结合蛋白质的功能基团，将活性蛋白质 (如抗体 )包覆在磁珠上，与具有抗原性的物质作用，形成磁珠 -抗体 -抗原复合物，在磁场力的作用下，复合物与其它物质分离93,94。然后利用可以催化 AMPPD 分解的 ALP 标记抗体，在免疫反应后加入 AMPPD，产生光信号，检测信号从而达到检测待测抗原含量的目的。林金明95利用该方法成功地对人唾液中的 hCG 进行了检测，灵敏度较分光光度法提高了 13 倍，线性范围为 0.15 500mIU/mL， 检测限为 0.072mIU/mL， 并与其它化学发光法的结果具有良好的相关性。该方法还广泛应用于其它肿瘤标志物如 CEA、

35、 AFP、 CA125、 CA199 等 TM 的检测中。 Mack 等96利用该方法使用 Liaison immunoanalyzer 对 hCG 进行了检测，获得了满意的结果。另外，林金明等97根据微流控芯片的制作原理，研制了中心混合的三流路化学发光流动注射专用芯片检测池， 极大地提高了发光试剂的混合效率和发光检测灵敏度， 开发了带有数据处理系统的 LUM-F流动注射化学测量仪和 LUM-P 液相色谱柱后化学发光检测器98,99，他们还研制和生产了我国第一台化学发光芯片专用检测仪 (LUM-Clip)，推出了国产第一台 96 孔板化学发光免疫分析仪(LUM-96)100，利用它对唾液中 h

36、CG 进行了检测，取得了令人满意的结果95。笔者实验室利用化学发光磁酶免疫法对血清中 free hCG 进行了检测，并将该方法与分光光度法进行了比较，两者具有较好的相关性，而化学发光法具有更好的灵敏度、重复性，检测过程更简便、快速。目前，图5 化学发光磁酶免疫分析原理示意图 Fig.5 Principle schematic diagram of chemliuminescence magnetic enzyme immunoassay http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 8 我们正利用化学发光磁酶免疫法对肿瘤病人的肿瘤细胞的骨髓微转移进行监测

37、， 以达到肿瘤转移早期发现、早期治疗的目的，提高患者的生存率。 电化学发光 (Electrochemiluminescence, ECL) 又称电致化学发光 (Electrogenerated chemiluminecencre)，是电极反应产物之间或者电极产物与体系中某组分通过化学反应所产生的一种光辐射。早在 1929 年， Harvey 就发现了鲁米诺 (Luminol)的电化学发光现象，但直到上世纪80 年代才真正应用于化学分析。电化学分析法弥补了化学发光法选择性较差的缺点，两者联用大大提高了方法的灵敏度和选择性。 Xu 等73利用 Ru(bpy)32+-NHS 电化学发光反应体系对血清

38、中的 PSA 进行了检测，灵敏度达到了 1.7pg/mL；张忠英等101运用电化学发光免疫技术，检测了血清细胞角蛋白 19 片段 (CYFRA21-1)和癌胚抗原 (CEA)的水平，发现 CYFRA21-1 和 CEA 联合检测，可以提高肺癌诊断的敏感性，该方法可应用于人群当中肺癌的筛查检测。刘冬妍等102研究发现，利用电化学发光法检测血清中的 CA125，可作为妇科肿瘤的辅助诊断，也可作为盆腔恶性肿瘤患者疗效判断的指标。 Wascher RA 等33将 ECL 与 RT-PCR 相结合，检测了血液与骨髓当中 Stc-1 mRNA 的表达水平， 它对于确定乳腺肿瘤细胞的血液、 骨髓微转移具有一

39、定的应用价值。 另外， Luo 等103将增强化学发光检测法与 CCD 成像技术结合，应用于重组肿瘤坏死因子(TNF-)的检测当中，充分利用了化学发光法简便、灵敏、高通量的优点，其检测的线性范围达9.0 312.0 pg/mL，检测限可以达到 1pg/mL。 Wang 等104利用 FCLA 与活性氧自由基反应产生光信号， 并采用成像技术成功地对小鼠体内的肿瘤进行了定位。 Tsukagoshi 等35将化学发光检测法、免疫分析法、 毛细管电泳和生物芯片四种检测手段有机结合起来， 充分利用化学发光的高灵敏度、免疫方法的高特异性、毛细管电泳的自动进样输送系统和生物芯片的微型化等优点，实现了分析检测

40、的微量、微型与快速的目的，并将该方法成功地对血清白蛋白和血清免疫抑制酸性球蛋白进行了检测，实验所用的发光试剂为异硫氰酸根合异鲁来诺 (ILITC)，将其标记在待测抗原上，利用待测抗原与 ILITC 标记的抗原之间发生免疫竞争，然后加入微过氧化物酶与 ILITC 作用分解，产生发光现象。该方法对 HAS 和 IAP 的检测范围都达到 1.010-7 5.010-6mol/L，检测限为1.010-7mol/L。 4展望 化学发光法作为一种高灵敏度、 线性范围宽的检测方法， 它的优越性逐渐为科学家们所重视，目前已被广泛应用于医药105、生物106、食品107、环境108、微生物109等各个领域。肿瘤

41、作为一类严重危害人们生命健康的恶性疾病，其早期诊断与治疗，对其预后具有十分重要的意义，对其复发与预后的监控是提高肿瘤患者生存率的一个重要方面。 肿瘤标志物作为现在临床中诊断肿瘤的重要指标，已被广泛应用于临床，传统检测方法精度不高，步骤繁琐，仪器要求高；化学发光法以其出众的优越性，已在临床中应用于肿瘤标志物的检测，但目前还仅仅停留在少数一些肿瘤标志物的分析检测，如 AFP、 hCG、 CEA 等。在国内，化学发光法在一些大中型医院应用较为广泛，而在一些基层医院应用还很少，所用仪器多为进口，价格昂贵，试剂以传统的发光试剂如鲁米诺及其衍生物为主，这些都无法满足国内发展与普及肿瘤治疗和检测手段的需要。

42、随着研究工作的不断深入，越来越多的性能优异的发光试剂将会出现，检测仪器将会不断更新换代，免疫学技术的发展会促使越来越多的特异性好的单克隆抗体出现， 使化学发光分析方法更好地应用http:/www.hxtb.org 化学通报 2005 年 第 68 卷 w135 9 于更多的肿瘤标志物的检测当中；尤其随着各种检测仪器之间联用技术的不断进步，例如化学发光检测法与高效液相色谱 (HPLC)技术的联用，可同时达到很好的分离与检测的目的。 CL 在肿瘤标志物检测中的应用与推广必将使肿瘤早期诊断成为可能，从而推动人类尽早攻克肿瘤。 参考文献 1 马文丽，郑文岭 . 分子肿瘤学 . 北京 : 科学出版社 ,

43、 2003: 4. 2 李宣海，巫向前，倪语星 . 肿瘤标志物的检测与临床 . 北京 : 人民卫生出版社 , 1997: 69167. 3 俞信祥，顾静欣，陆卫国 等 . 上海医学检验杂志 , 1995, 10(3): 163. 4 林金明编 . 化学发光基础理论与应用 . 北京 : 化学工业出版社 , 2004. 128. 5 B Velan, M Halmann. Immunochemistry, 1978, 15(5): 331333. 6 D K Xu, L R Ma, Y Q Liu et al. Analyst, 1999, 124(4): 533536. 7 章竹君，张书圣，张新

44、荣 . 分析化学 , 1994, 22(6): 539542. 8 刘农乐，王芳，蒋滋慧 等 . 免疫学杂志 , 1995,11(4): 359361. 9 A T Hashem, L V Reddy, S Siripurapu et al. Clin. Chem., 1998, 44(9): 20552066. 10 A Roda, P Pasini, M Baraldini et al. Anal. Biochem., 1998,257: 5362. 11 D Melucci,., B Roda, A Zattoni et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1056:

45、 229236. 12 G H Thorpe, L J Kricka, E Gillespie et al. Anal. Biochem., 1985, 145: 96100. 13 C E Olesen, J Mosier, J C Voyta et al. Methods Enzymol, 2000, 305, 417427. 14 H Sasamoto, M Maeda, A Tsuj et al. Anal. Chim. Acta, 1995, 309: 221225. 15 M D Xue, T Haruyama, E Kobatake et al. Sens, Actuators

46、B, 1996, 36: 458462. 16 庄惠生，王琼娥，陈国南 等 . 光谱学与光谱分析， 2000， 20(6): 889891. 17 庄惠生，王琼娥，陈国南 等 .高等学校化学学报， 1998, 19(12): 19331936. 18 I Bronstein, P McGrath. Nature, 1989, 338: 599.I Bronstein, J C Voyta, B Edwards. Anal. Biochem., 1989, 180: 9598. 20 W G Wood, D S E Van, A Bohle et al. Eup. J. Clin. Chem.

47、Clin. Biochem., 1991, 29(12): 787794. 21 M Gion, R Mione, A E Leon et al. Clin. Chem., 1999, 45(5): 630637. 22 H Matsushita, J Xu, M Kuroki et al. Eup. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1996, 34(10): 829835. 23 C M Sanchez, A Espasa, V Chinchilla et al. Clin. Chem., 1999, 45(11): 19441953. 24 G Yan, H Ju, Z Liang et al. J. Immunol Methods, 1999, 225(12): 18. 25 A D Pronovost, A Baumgarten. Experientia, 1982, 38(3): 304306. 26 R Haggart, G H Thorpe, S B Moseley et al. J. Biolumin. Chemilumin., 1986, 1(1): 2934. 27 G Stefano, M Monica, F Elida et al. Anal. Biochem., 199