1、1,第八章 免疫分析(三),2,8.4 荧光免疫分折(Fluorescenct immuno-assay, FIA),将荧光法引入免疫分析主要是因为它与分光光度法相比具有高的灵敏度。其灵敏度是分光光度法的10-1000倍。人们寻找单分子检测的工作几乎都围绕着荧光化合物，这本身就反映了荧光法在提高分析灵敏度方面的潜力。另外，荧光测定可以把荧光激发波长、荧光发射波长、荧光寿命或偏振等参数同时结合起来，形成特异而花样繁多的分析系统。由于荧光化合物的微环境会影响上述参数，荧光光谱常常使得直接研究一些分子过程成为可能。,3,8.4.1 荧光标记物FIA就是把一些强荧光的化合物用作标记试剂。常用的荧光标记
2、物包括：,荧光素类(fluoresceins)标记物荧光素具有很高的摩尔吸光系数和荧光量子产率，因而它是荧光免疫分析中最常用的荧光标记物之一。,罗丹明类(Rhodamine)标记物罗丹明类衍生物与荧光素类具有相同的基本结构。与荧光素类化合物相比，它们的发射波长要长一些，但荧光量子产率要低一些。,4,香豆素类(Coumarins)标记物,藻胆蛋白类(Phycobiliproteins)标记物藻胆蛋白类的水溶性非常好，它们是蓝绿细菌的光合成器的一部分。在它们的结构中含有几个线性四吡咯辅基，因而具合很高的吸光能力。这类化合物常在微粒荧光免疫分析中被用作荧光探针。,5,8.4.2 在生物体液中进行荧光
3、测定的局限性,(1)光散射干扰由于蛋白质、类脂物及胶体颗粒对激发光的散射，将会出现瑞利散射、拉曼散射或丁达尔散射。瑞利散射和丁达尔散射与激发光波长相同，但拉曼散射的波长要比激发光的长。散射光无寿命，即随着激发光的终止而消失。 (2)背景荧光干扰生物体液中含有多种荧光物质，其荧光光谱覆盖很宽的波长范围，因而会产生非常强的背景荧光。,6,(3)淬灭效应血清中的蛋白质、胆红素及血红蛋白等可以吸收激发或发射光的能量而产生淬灭现象。荧光标记的抗原与血清蛋白的结合也会产生荧光淬灭。(4)光漂白作用当荧光分子受到激发光的连续照射时会产生光分解而使得荧光强度减小，特别是当激发光的波长短，而激发光的强度又非常大
4、时更是这样(如采用激光光源时)。,7,8.4.3 荧光免疫分析的仪器,所有用于荧光免疫分析的荧光仪都由光源、激发和发射滤光片或单色器、一个光学系统(可以是棱镜、反射镜或光导纤维)和一个检测系统组成。更复杂的仪器还可以包括移液、洗涤、移动和数据处理单元。时间分辨荧光仪有一个电子回路用于控制测定时间。这类复杂的仪器一般都是为特定的化学分析系统所设计的，所以所有的测定参数都已经预先优化好了，并且是固定的。,8,8.4.4 荧光免疫分析法示例,时间分辨荧光免疫分析法（Time - Resolved Fluorescence，简称TRF） 用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、同位素或酶)，
5、标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如：抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，以此来判断反应体系中被测物质的浓度。,9,TRF 分析法的优点：标记物体积很小(为原子标记)，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小)；实现了多位点标记，这不仅使检测更灵敏，也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两中以上的项目（如前列腺特异抗原PSA的检测）；目前只有原子标记才能准确的定量检测DNA、RNA。,10,稀土原子具有的荧光发射峰谱范围窄、激
6、发光波长范围宽的特点，有利于增强荧光的特异性，提高分辨率；激发光和发射光之间存在较大的STOKES位移(激发光与发光之间的能量差 )，有利于排除非特异性荧光的干扰、降低本底荧光强度；稀土离子螯合物产生的荧光强度高、寿命长，有利于消除环境中其它荧光物质的影响，并可对样品进行多次检测。,11,时间分辨荧光免疫分析技术具有标记物制备简便、有效期长、不污染环境、操作流程短、标准曲线线性范围宽、有效期长、应用范围十分广泛等优点。虽然问世仅十余年，但在方法学研究和应用方面均发展迅速。国外( 如：WALLAC公司)已有商品化试剂盒40余种，荧光测试仪研制已进入第三代，分析技术也已实现高度自动化。,12,8.
7、5 免疫分析发展趋势,在免疫分析的诸方法中，放射免疫分析是第一个定量方法，而且至今也还有一些使用。放免分析准确而灵敏，但由于放射性风险和需要特殊的仪器。因此，研究工作者很早就开始寻找可以取代它的新方法。酶联免疫分析是最先提出的一种，并在进入八十年代后首次占据主导地位其方法覆盖了一半以上的文献。荧光免疫分析在建立时间分辨荧光免疫分析后有了突跃性发展，占目前工作的1015，成为具有发展前途的非放射免疫分析方法之一。非同位素标记分析中另一个值得重视的方向是发光免疫分析法，由于方法的高灵敏度和测定的简单在免疫分析中一直占有一定的位置，每年约占5的工作。,13,从发展的趋势来看，在今后比较长的一段时间内
8、，酶免疫分析法将仍占主导地位，特别是在应用方面更将是如此；而在研究方面，以下诸方面的工作将有待于进一步拓展和深入。,14,8.5.1 基因工程抗体,从被免疫的动物血清中获得的抗体是多克隆抗体，虽然用于免疫分析的效果是良好的，但缺点是抗体不均一，来源是不连续的而且有较大的批间差别。自七十年代发展了单克隆抗体技术，到现在已经很成熟。单克隆抗体克服了多克隆抗体的上述缺点并且在一些方面进一步提高了抗体的性能。近年来、一类特殊的单克隆抗体抗独特型抗体开始在应用中受到广泛的关注。,15,抗独特型抗体(Antiidiotypic antibody)免疫系统的抗独特型反应可以导致产生一类特殊的抗体抗独特型抗体
9、。通过单克隆抗体筛选可得到、和等型抗体。抗独特型抗体的特点是其结合位置是独特型抗体的抗原结合位点，即抗独特型抗体的结合反应性质类似抗原。其中型反应性与抗原完全相向，可与抗原对独特型抗体进行等结合位点的竞争结合，因而在目前分析中应用较多。例如，利用雌二醇受体的抗体的结合位点可模拟雌二醇的结构，两者相互竞争，可用于测定雌二醇。,16,双特异性抗体(Bispecific antibody)因为抗体是由四条肽链组成(HL2)型结构，所以通过两个不同单克隆抗体细胞系的二次融合杂交和抗体筛选便可得到具有两个不同的抗原结合位点的抗体(L1H1-L2H2型)。这就是双特异性抗体。双特异性抗体的一个有趣的特点是
10、抗体的两个结合位点具有一定的协同作用，除了研究意义外，双特异性抗体的这种协同作用已被用来设计均相免疫分析法。,17,双功能抗体(Bi-functional antibody)双功能抗体主要是通过基因工程的方法，将酶结合到抗体重链部分的恒定区，使抗体同时具备酶的功能。其特点在于抗体酶标记的效率达到100。,18,8.5.2 生物素-亲和素体系的多重标记,提高分析灵敏度的一个有效方法就是增加抗体(或抗原)的标记率。小分子探针不存在空阻效应，因而多重标记法可以获得成百上千的标记率，尤其是镧系螯合物探针，由于没有有机荧光分子的多重标记时荧光淬火现象，加上多重标记荧光增强效应，可以获得到10001000
11、0倍的荧光增强。,19,为了避免标记对抗体结合活性的影响同时也可以进一步提高探针的偶联数量，需要采取多重标记的方法。在诸多方法中，以应用生物素-亲和素反应对的方法备受崇。,20,生物素亲和素标记系统的优势在于： 1.试剂来源广泛和较易提取， 2.生物素与亲和素结合速度较快并且结合物的稳定性高； 3.生物素分子易于活化，然后再与蛋白质分子相偶联，生物4.素标记可以达到较高的偶联率而不影响抗体的生物活性； 5.生物素亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，以适应不同的分析设计； 6.标记体系采用分别标记的方法(生物素标记抗体，探针标记亲和素)，经过探针标记的亲和素使之成为通用试剂，非常适合于试剂的商品
12、化。,21,8.5.3 自动化免疫分析法,早期免疫分析通过观察沉淀物形成，凝集及溶血现象发生来分析，如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、补体结合等 上世纪50年代末60年代初，利用AG-AB复合物形成使浊度改变，再用比浊计来比浊，但因其敏感性差未被接受 70年代初，开始有自动检测系统，但因其用的是激光为光源，固定波长，灵敏度较低，而且时间一般要23小时,22,70年代未，速率比浊计的出现，使抗原抗体结合的反应在几十秒内出结果，可以说是免疫化学测定的革命的发展 随着标记技术的发展，免疫化学可以纳入临床化学检验范畴 现在，自动化免疫分析系统发展迅速 自动化免疫分析的基础是抗原抗体的结合，具有高特异性；
13、手段多是利用标记技术而将检测信号放大，具有高灵敏度。,23,自动化免疫仪器种类（应用技术）,免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术,24,免疫比浊,利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检测的一种方法 此法准确快速，已成为免疫诊断技术中重要的检测手段 比浊法与比色法,25,散射免疫比浊分析法,基本原理：抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关,26,免疫透射比浊,基本原理：检测信号是通过溶液的光，测量角度与正前方夹角为0，保持抗体过量，形成可溶性AG-AB复合物，使介质浊度发生改变
14、。 实验要求：选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要大、数量要多，反应时间充分。,27,胶乳浊度测定法,基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比（图）,28,光波,胶乳浊度测定法原理,d,d 2d,29,影响免疫比浊的因素,抗原抗体比例 抗体纯度和效价 增聚剂（PEG）,30,自动免疫浊度分析仪的要求,校准程序，使仪器处于正常的工作状态 定标程序，保证检测结果的准确性 自动控制，保证实施实验
15、条件中的抗原抗体反应体系要求 自动系统，障碍的检测和预警。,31,化学发光自动免疫分析,化学发光是指在化学反应过程中产生光的发射现象 基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物质在碱性介质中氧化时产生激发态的中间体，中间体回基态时产生辐射，多余的能量为发射光子，产生发光现象，再对光信号进行接收转化，可得检测物浓度 发光物质须具备：氧化致发光、光量子产额高、理化性能好,32,化学发光自动免疫分析类型,化学发光免疫分析（CLIA）是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。,33,化学发光酶免疫
16、分析（CLEIA）以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。,34,微粒子化学发光免疫分析（ECIA）也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。,35,电化学发光免疫分析（ECLIA）一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高 以双抗体夹心法为例之图示（图）,36,ECLIA体系结构图,37,ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）,38,E
17、CLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）,39,ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）,40,ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）,41,ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）,42,化学发光免疫分析是免疫技术、发光技术和计算机系统的结合，具有特异性强、灵敏度高（pg/ml)、精密度好、准确度好等特点，越来越多的人体微量指标应用这种方法来检测，已渐渐代替了RIA。,43,流式细胞仪,流式细胞仪（FCM）是以激光为光源，检测生物学颗粒理化性质的仪器 生物学颗粒包括免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细胞、染色体、真核细胞等 理化性质则
18、为细胞大小、形状、胞浆颗粒、DNA含量、酶活性等,44,FCM综合了激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学及计算机技术，被称为实验室“CT” FCM现正广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验学等,45,流式细胞仪基本原理,基本原理：单个经荧光染料染色的细胞经过激光激发后，发射的荧光在不同的角度进行测量，并对其信号进行综合分析（图） 细胞分选原理：通过测量区的细胞若其参数符合实验设计的条件，在经过偏转板时被充上相应的电荷并被偏转收集（图）,46,47,48,液流系统：样本和鞘流液组成（图） 光学系统：光源可为汞灯或激光 信号接收系统：散射光和荧光的检测,流式细胞仪
19、基本组成,49,侧向荧光信号,鞘流,前向散射光,流式细胞流动池示意图,喷嘴,激光束,50,荧光测量,荧光染料染色的细胞通过测量区时，细胞中特异性荧光物质受激发产生荧光信号，后者强弱表示待测物质的多少 荧光的检测系统由滤光片和检测器组成，滤光片的作用是使激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值，滤除非荧光信号，提高荧光的检测强度,51,流式细胞仪免疫分析的技术要求,仪器性能指标：荧光分辨率、荧光灵敏度、前向角散色光灵敏度、前向角散光分辨率、分析/分选速度、分选纯度、分选收获率 检测样品要求要单细胞悬液 荧光标记常用的染料有异硫氰基荧光素、藻红蛋白类 全程质量控制,52,流式细胞仪的临床应用,细胞生物学：周期分析 免疫学：与单克隆抗体结合应用，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性等方面都起着相当重要的作用 肿瘤学：基因水平的分析，为肿瘤的诊断、治疗及预后评价提供重要的信息 血液学：分析正常细胞与肿瘤细胞,
