1、摘要 目的 通过观察 APP17 肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株 SY5Y 生长的影响，从细胞水平证实此肽有促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。方法 将细胞计数、MTT 代谢率及 LDH 漏出率作为观察指标。结果 APP17 肽可使细胞数和 MTT 代谢率明显增加，高糖环境下细胞数和 MTT 代谢率明显降低，LDH 漏出率升高，此时加入 APP17 肽仍可使 MTT 代谢率增加。结论 APP17 肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。在无胰岛素的情况下，高糖环境对神经元有损伤作用，而 APP17 肽对神经元有一定的保
2、护作用。Effect of APP17 peptide on the neurotoxicity of high glucoseWang Rong,Zhang Jingyan,Zhang Dai,et al(Capital University of Medical Sciences,Xuan Wu Hospital,Beijing Aging Research Laboratory,Beijing 100053)abstract Objective To observe the effect of APP17 peptide and a high glucose environment on
3、 the growth of human neuroblastoma cells,SY5Y,to prove that this peptide can enhance neuronal growth from a cellular perspective,and to make preliminary observations of its preventive effect on the neurotoxicity of high glucose.Methods Cells number,MTT metabolic rate and LDH leakage rate were assess
4、ed.Results APP17 peptide significantly increased cell number and MTT metabolic rate.Cell number and MTT metabolic rate were reduced,and LDH leakage was increased in a high glucose environment,but the addition of APP17 peptide under such conditions can still raise MTT metabolic rate.Conclusion APP17
5、peptide had neurotrophic effect and promoted mitochondrial activity,therefore it may be a metabolic enhancer.In the absence of insulin a high glucose environment was neurotoxic,and APP17 peptide was neuroprotective.Key words APP17 peptide High glucose environmentAPP 是 -淀粉样肽(-Amyloid,A 或 /A4)的前体蛋白(am
6、yloid /A4 protein precusor,APP)1 。APP695 由 695 个氨基酸组成 2 ，其中 319335 肽段为 APP17 肽(APP 17-mer peptide)3 。已有报道，大鼠脑内注射此肽段两周，即可引起细胞学及行为学方面的改变，并能提高动物的学习记忆能力 4 。本实验室近年来对 APP17 肽进行了免疫组织化学方面的研究，结果表明它能明显改善糖尿病脑病动物海马神经元的退变(未发表资料)。葡萄糖作为动物体内能量来源之一，参与细胞生长代谢过程。但在缺乏胰岛素的情况下，高于体内正常水平的葡萄糖对神经元是否存在损伤作用，却少有报道 5 。本研究目的在于通过观察
7、 APP17 肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株(human neuroblastoma cells)SY5Y 生长的影响，从细胞水平证实此肽促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。材料和方法一、材料1.SY5Y 细胞株：由瑞典卡罗琳斯卡研究所 Bengt Winblad 教授和裴进京博士赠送。细胞培养条件为 MEM(Gibco BRL,41500-034)培养基中加入 10%胎牛血清(Sigma,F4135)15mmol/L HEPES(DNN company)、青霉素 100IU/ml、链霉素 100IU/ml 及 5% CO2，37，每周换液两次，传代 1 次
8、。2.APP17 肽：由本研究室用固相法合成，高效液相(HPLC)纯化，纯度接近 100%。3.3-4，5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium broide(MTT)：Sigma 产品。4.二甲基亚砜(DMSO)：北京亚太精细化工公司。5.乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒：北京化工厂，编号 001012。二、方法1.APP17 肽对 SY5Y 生长的影响：(1)细胞计数：将 SY5Y 细胞以密度为 1104/ml 接种于 24 孔板(Costar 产品)，24 小时后细胞贴壁生长，将其分为对照组、APP17 肽 1mol/L 组和 10mol
9、/L 组，每组 8 孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。(2)MTT 代谢率测定：将 SY5Y 细胞以密度为 2.5103/ml 接种于 96 孔板(Costar 产品)，24 小时后将其分为对照组、APP17 肽 10mol/L 组，每组 12 孔。于接种后第七天，每孔加MTT(5mg/ml)20l，37孵育 4 小时，吸出培养液，每孔加入 DMSO 200l，振摇 10 分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定 550nm 处光密度值(OD)。(3)LDH 漏出率测定：将 SY5Y 细胞以密度为 1104/ml 接种于 24 孔板，24 小时后将其分
10、为对照组和 APP17 肽 10mol/L 组，每组 8 孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，按照 LDH 测定试剂盒所示方法(比色法)，测定 550nm 处光密度值，同时做 LDH 标准曲线。(4)统计学处理：应用 SPSS 软件做成组 t 检验统计。2.高糖环境对 SY5Y 生长的影响：(1)细胞计数：将 SY5Y 细胞以密度为 1104/ml 接种于 24 孔板，24 小时后细胞贴壁生长，换无血清培养液，将细胞分为对照组、高糖组(葡萄糖 8.33mmol/L)和高糖加 APP17肽 10mol/L 组，每组 8 孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。(2)MTT 代谢率测定：将
11、 SY5Y 细胞以密度为 2.5103/ml 接种于 96 孔板，24 小时后换无血清培养液，将细胞分为上述 3 组，每组 12 孔。于接种后第七天做 MTT 代谢率测定。(3)LDH 漏出率测定：将 SY5Y 细胞以密度为 1104/ml 接种于 24 孔板，24 小时后换无血清培养液，将细胞分为上述 3 组，每组 8 孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，测定 LDH 漏出率。(4)统计学处理：应用 SPSS 软件做成组 t 检验统计。结 果1.细胞计数结果显示：从接种第六天开始，APP17 肽组细胞数增加，1mol/L 组与对照组相比，P0.05，10mol/L 组与对照组相比，P0.0
12、1；接种后第九天，APP17 肽组细胞数仍高于对照组，有高度显著性差异(表 1)。而高糖组细胞数从第三天始，明显低于对照组，二者相比 P0.01，且一直持续至第九天；高糖加 APP17 肽组与高糖组相比，细胞数无显著性差异(表 2)。2.MTT 代谢率测定结果显示：APP17 肽组 OD 值为 0.4400.004，明显高于对照组(0.1600.012)，增加幅度为 175%，两组相比 P0.01。而高糖组 OD 值为 0.660.06， 明显低于对照组(0.870.02)， 降低幅度为 26.15%，P0.01。高糖加 APP17 肽组 OD 值为 1.050.14，明显高于对照组，升高幅度
13、为 20.08%，P0.01。表 1 细胞计数观察 APP17 肽对 SY5Y 生长的影响(10 4/ml， s)分组 例数 接种时 第三天 第六天 第九天对照组 8 1 1.630.52 2.150.58 6.101.33APP17 肽 1mol/L 组 8 1 1.560.59 3.020.71* 8.100.75 *APP17 肽 10mol/L 组 8 1 1.520.91 3.920.79* 11.044.19*与对照组相比 *P0.05，*P0.01 表 2 细胞计数观察高糖环境对 SY5Y 生长的影响(10 4/ml， s)分组 例数 接种时 第三天 第六天 第九天对照组 8 1
14、 5.001.15 5.380.91 3.050.57高糖组 8 1 2.460.98 * 1.170.58 * 1.000.47 *高糖加 APP17 肽 8 1 2.330.88 2.250.92 1.000.32与对照组相比 *P0.01 3.LDH 漏出率测定结果显示：APP17 肽组 LDH 为254.344.1U，与对照组(306.371.8U)相比无显著性差异。高糖组 LDH 为1760.216.6U，明显高于对照组(503.578.6U)，P0.01。高糖加 APP17 肽组 LDH 为 1 560.025.8U，低于高糖组，P0.01。讨 论A 是 APP 的近 C 端肽段，
15、在老年性痴呆(Alzheimers diseases,AD)的发病过程中起重要作用 6 。而可溶性 APP 中的 APP17 肽却可促进神经元生长 7 ，如使前脑皮质突触前膜的数量增加 18%4 ，轴突延长 8 ，提高动物的学习记忆能力。本实验表明，APP17 肽可使 SY5Y 细胞数明显增加，且呈剂量依赖关系。MTT 为噻唑蓝，被培养的细胞摄取后，通过线粒体代谢生成甲赞(formazan)，故线粒体活力越旺盛，甲赞生成越多，光密度值也越高。本研究显示，无论是在正常情况或者是在缺乏胰岛素的高糖环境下，APP17 肽均可使SY5Y MTT 代谢率升高，说明 APP17 肽可以刺激细胞线粒体活性增
16、加。在高糖环境下，虽然APP17 肽组的细胞数并未增加，但 MTT 代谢率却显著高于对照组，说明 MTT 升高是由于每单位数量细胞线粒体活性增加所致。APP17 肽是否作为一种代谢促进剂参与细胞生长活动，尚待进一步研究证实。高糖环境下，SY5Y 细胞数明显减少，MTT 代谢率下降，LDH 漏出率升高，说明高糖环境对神经元生长有损伤作用。此时加入 APP17 肽只能使 MTT 代谢率升高，不能使细胞数增加，说明在细胞受损时，APP17 肽仍有增加细胞线粒体活性的作用，但促细胞生长作用减弱。虽然 APP17 肽在高糖环境中不能使 SY5Y LDH 漏出率降至正常，但与高糖组相比有高度显著性差异，说
17、明在外界损伤条件存在下，APP17 肽对神经细胞仍有一定保护作用。本实验结论为：APP17 肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。在缺乏胰岛素的条件下，高糖环境对神经元有损伤作用，而 APP17 肽对神经元有一定保护作用。参 考 文 献1，Goldgaber D,Lerman MI,McBride OW,et al.Characterization and chromomal localization of cDNA encoding brain amyloid of Alzheimers disease.Science,1987,235:877.2，
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