1、 南京探求生物技术有限公司电话：025-81682922 传真：025-85860962地址：南京经济技术开发区生物医药工业园 5 号楼电子邮件： sales 网址： http:/使用说明一产品介绍MPEI 是针对一些常用贴壁细胞设计的经济型产品，该试剂由一种不可降解的分枝状 PEI衍生物与其它组分复合而成。对绝大多数贴壁细胞系具有较高的转染效率，特别适用于各种常规细胞如 293，CHO，COS，A549，LLC，B16F10 等细胞的转染。可进行寡核苷酸和siRNA 运送。也能用于体内的动物实验。MPEII 与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要表现为： 经济实惠
2、，适用于大多数常用的贴壁细胞系。 转染效率高，细胞毒性低。 使用较少的 DNA 量即可获得高的转染效率。 培养基可含或不含血清，可以用 PBS 或不含血清的培养基稀释 DNA 进行转染，转染过程中不需换液。 转染方法操作简单，转染过程快速。 转染的重复性好，可进行寡核苷酸和 siRNA 运送。 需要较少的转染条件优化二运输与储存运输：常温 储存：28 一年； 15 至20 二年以上三转染前的准备与注意事项1细胞接种为了取得较高的转染效率，推荐使用在 50 代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前 24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般应为 60-80%
3、，但这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度为 70-90%。以24 孔板的转染为例，最理想条件是在转染前 24 小时，每孔接种(500 l )0.5210 5 个细胞。在大多数情况下，如果在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染，也可以得到相近的结果。表 1 列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量。2DNA 的质量为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒。仅仅根据 DNA 电泳条带的情况估计DNA 的量和纯度是不够准确的。建议对提取的质粒 DNA 的量和纯度进行检测，DNA 含量 (g/mL)=50 (260 nm 的读数) 稀释倍数，通过检测质粒 DNA 在 260nm 和 2
4、80nm 的 OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，OD260/OD280 值应该1.8。转染时不同品质南京探求生物技术有限公司电话：025-81682922 传真：025-85860962地址：南京经济技术开发区生物医药工业园 5 号楼电子邮件： sales 网址： http:/的 DNA 用量不同，以 24 孔板转染为例，使用酚氯仿沉淀法提取的质粒 DNA 一般每孔需要加入2g 质粒 DNA，而使用 Qiagen 分离柱或类似方法提取的质粒 DNA 一般每孔需要加入 0.5-1g质粒 DNA。表 1 不同细胞培养装置转染前一天细胞接种的推荐细胞数量细胞培养装置 接种细胞数
5、量 每装置面积（cm 2/孔或皿） 细胞培养液总体积 （每孔或每皿）*96 孔板 10 000 - 30 000 0.3 0.1 ml - 0.2 ml48 孔板 30 000 - 80 000 1 0.25 ml - 0.5 ml24 孔板 50 000 -200 000 1.9 0.5 ml - 1 ml12 孔板 80 000 - 400 000 3.8 1 ml - 2 ml6 孔板/ 35 mm 培养皿200 000 - 600 000 9.4 2 ml - 4 ml60 mm 培养皿 400 000 - 800 000 28 5 ml - 10 ml100 mm 培养皿 1 000
6、 000 2 000 000 78.5 10 ml 20 ml140 mm 培养皿 2106 5106 153 20 ml 40 ml为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积，转染 2 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。3血清的影响与大多数脂质体转染试剂不同的是，在转染过程中细胞培养基中包含血清反而可以提高转染效果。但是在 MPEI 和 DNA 形成转染复合物的过程中不能添加血清。转染复合物的制备过程中可以使用不含血清的培养基或细胞实验室常用的 PBS 稀释质粒 DNA 和转染试剂。4MPEI 的用量在体外细胞转染试验中，对于接种细胞密度在 60%-90% 之间的实验样本，可通过预试验
7、在MPEI（ l）DNA（ g）= 21 61 之间选择最佳的比例。对大多数细胞MPEI（ l）DNA（ g）的推荐比例为 21。在动物体内转染试验中，动物肿瘤模型的建立需要根据研究情况进行选择；核酸的给药剂量可根据需要进行调整，其与 MPEI 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定，但通常 DNA/RNA/siRNA/（ g）：MPEI（ l）1:2 1:3；核酸的给药途径可根据研究情况确定，可选择静脉注射、肌内注射、瘤内注射、腹腔注射等。南京探求生物技术有限公司电话：025-81682922 传真：025-85860962地址：南京经济技术开发区生物医药工业园 5 号楼电子邮件： sal
8、es 网址： http:/5PBS 配制方法800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl, 0.2g KCl, 3.63g Na2HPO4.12H2O(或 1.44g Na2HPO4) 和 0.24g KH2PO4, 用 HCl 调节溶液 pH 至 7.4 加水定容至1L，高压灭菌 20 分钟，保存于室温。（见“分子克隆实验指南” 第二版 P927）四操作步骤贴壁细胞转染(以 24 孔板转染为例) 1 g DNA 质粒稀释于 50 l 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的 PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也
9、能用于稀释 DNA 和转染试剂。 2 l MPEI 稀释于 50 l 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的 PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释转染试剂和 DNA。 50l MPEI 稀释液滴加到 50 l DNA 稀释液中，轻轻混匀, 室温孵育 10-15 分钟，从而获得 100 l MPEI/DNA 复合物。为简化操作，在充分注意及时混匀的前提下，前面几步可以合并为一步完成：将 1 g DNA 质粒稀释于 100 l 不含血清和抗生素的培养基或 PBS 中，轻轻混匀，然后加入 2 l MPEI
10、 后立刻混匀，室温放置 10-15 min，获得 100l 转染复合物。注意：两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒顺序。同时室温孵育时间最好不超过 20 分钟，然后立即加入到培养基中。通常将孵育 10-15 分钟后 MPEI/DNA 复合物与培养基在 EP 管中混合后再加入每孔中转染效果更好。 100l MPEI/DNA 复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合。注: 接种细胞的 0.5 ml - 1 ml 的培养基，在进行转染时已经 24 小时了，如果已经发黄，最好在转染时更换为新鲜的培养基。 把细胞放置在 37，CO 2 孵育箱孵育 24-48 小时后，分析报告基因
11、转染效率。悬浮细胞转染为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积（见表 1 细胞培养液总体积的下限或更低一些），转染 2-3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。以 24 孔板转染为例，具体为以细胞培养液总体积的下限（500l ）接种细胞 2 小时后，加入同样方法制备的 100 l MPEI /DNA 复合物，轻轻摇动使均匀混合，转染 2 h 小时后补加含血清细胞培液至总体积 1 ml，继续培养至 24-48 小时后，分析报告基因转染效率。高通量系统实验步骤 (在 96-孔板上的转染)转染复合物的制备 对每孔, 在 EP 管中将 200 ng DNA 稀释于 15 l PBS 中, 轻轻混
12、匀。 对每孔, 在 EP 管中将 0.4 l 的 MPEI 溶液稀释于 15 l PBS 中, 轻轻混匀。 将 15 l MPEI 稀释液加到 15 l DNA 稀释液中，轻轻混匀。南京探求生物技术有限公司电话：025-81682922 传真：025-85860962地址：南京经济技术开发区生物医药工业园 5 号楼电子邮件： sales 网址： http:/注意: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒滴加顺序。 轻轻振荡混匀后，室温下静止 10-15 分钟后，立刻加入到每孔中。细胞的接种与转染 细胞经胰酶消化后，用新鲜的含血清的培养基洗一次，然后在 96 孔板上接种细胞，每孔200
13、 l 20 000 个细胞 , 细胞培养 24 小时后进行转染。 将上述制备好的 30 l MPEI/DNA 复合物滴加到每孔中，轻轻摇动细胞培养板使转染复合物均匀分散。 在 37C，5% CO 2 下培养。24 48 小时后，分析报告基因转染效率。 动物体内转染质粒 DNA（或其他核苷酸类成分）用量与 MPEI 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定，但通常 DNA/RNA/siRNA/（ g）：MPEI（ l）为 1:2 1:3；核酸的给药途径可根据研究情况确定，可选择静脉注射、肌内注射、瘤内注射、腹腔注射等。以小鼠瘤内注射进行基因治疗为例：(1) 肿瘤细胞株接种于小鼠背部皮下，定期用游
14、标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100 mm3 后将动物随机分组给药。肿瘤体积(tumor volume ,TV)的计算公式为：TV = 1/2 a b2 其中 a、b 分别表示长宽。（2）10g（1g/l）质粒（或其他寡核苷酸类成分）与 20l PBS 在 1.5 ml 无菌 EP 管中混匀后，再加入 20l MPEI 混匀，室温放置 10-15 min，获得 50 l 转染复合物。（3）瘤体局部消毒后，将前述的 50l 转染复合物直接注射到小鼠肿瘤内。（4）动物继续饲养，如需要多次给药，则转染方法按 (2), (3) 进行。定期用游标卡尺测量移植瘤直径，计算肿瘤体积。（5）处死动物手术剥取瘤块进行分析。
