1、实验二 血清总蛋白测定（双缩脲法）血清总蛋白是血清中所有蛋白质的总称，正常人含量为 60-80g/L。按不同的分离方法可将血清蛋白质分为不同的组分。从目前临床生化实际应用上，血清总蛋白分为清蛋白和球蛋白两大类，其中球蛋白又分为 1 球蛋白、2 球蛋白、 球蛋白、 球蛋白四种。正常成人每天所合成的血清蛋白质中，清蛋白及大部分 1、2、 球蛋白是肝脏合成的， 球蛋白（大部分是免疫球蛋白）则主要来源与浆细胞。总蛋白测定，一般利用下列四种蛋白质的结构或性质进行：重复的肽键结构；酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收；与染料的结合能力；沉淀后借浊度或光折射测定。目前临床应用最广泛的方法是利用蛋白质分子
2、中的多个肽键与双缩脲试剂显色法。【目的】1. 熟悉血清总蛋白测定的原理及基本操作。2. 掌握血清总蛋白测定的临床意义。【原理】蛋白质分子中的肽键（-CONH-）在碱性条件下能与 Cu2+ 作用形成紫红色络合物。此呈色反应与双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与 Cu2+ 作用产生紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。反应中溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度法定量检测蛋白质的含量。凡具有两个以上肽键结构的化合物均有此反应，因此双缩脲反应广泛用于肽及蛋白质定性、定量检测。【器材】恒温水浴箱、分光光度计、刻度吸管、微量移液管、试管、试管架。【试剂】16molL NaOH
3、 溶液 称取 NaOH（优级纯）240g，溶解于新鲜蒸馏水中并加至 1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。2. 双缩脲试剂 精确称取结晶硫酸铜(CuSO45H20)3.0g，酒石酸钾(NaKC4H4O64H2O) 9.0g，碘化钾(KI)5.0g，用 500m1新鲜蒸馏水溶解。在搅拌下，加入 6molL 氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水稀释至 1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。370g/L 蛋白标准液 可用商品血清蛋白标准液，也可收集混合新鲜血清用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，加叠氮钠防腐，冰冻保存。4.154mmol/L氯化钠溶液 称取氯化钠 0.9g，用蒸馏水溶解并稀释至 10
4、0ml。【操作】取 3支试管，按表 3-2操作。表 3-2 血清总蛋白测定加入物（ml） 测定管 标准管 空白管血清 0.1 蛋白标准液 0.1 154mmol/L氯化钠溶液 0.4 0.4 0.5双缩脲试剂 5.0 5.0 5.0充分混匀，置 37水浴中 10分钟（或 2530 分钟） ，在 540nm波长处进行比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】 g/L 【正常参考范围】6080g/L【注意事项】1由于各种蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用 mol/L表示，而用 g/L表示。2.试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。3.高脂、黄疸和溶血标本应作血清空白对照，以保证结果准确。含脂类
5、极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚 3ml抽提后再进行比色。【临床意义】1.血清总蛋白降低（1）合成障碍：肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，其中以清蛋白下降最为明显。（2）丢失过多：见于严重烧伤时大量血浆渗出，大失血，肾病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量的蛋白质等。（3）营养不良或消耗增加:长期低蛋白饮食、慢性胃肠道疾病所引起的消化道吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或长期患消耗性疾病，如结核病、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进等均可引起血清蛋白浓度降低。（4）血液稀释：静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。2.血清总蛋白增高（1）血液浓缩：急性失水（严重腹泻、呕吐、高热等） ，休克（毛细血管的通透性增加） ，慢性肾上腺皮质功能减退, 急性失水尿钠增多引起继发性脱水。（2）合成增加:主要是球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤。【结果及分析】【思考题】1. 蛋白质常见的呈色反应有哪些？2. 微量凯氏定氮法测定蛋白标准液浓度的理论依据是什么？
