1、第五章 分子发光光谱法,5.1 荧光Fluorescence,5.2 磷光Phosphorescence,5.3 化学发光Chemiluminescence,F,P,C,5.1 荧光Fluorescence,5.1.1 产生,13:33:29,泡利不相容原理,单重态singlet state: 在磁场中无能级分裂,5.1.1 产生,13:33:29,单重态基态S0,单重态基态S0,泡利不相容原理,三重态triplet state,激发后 S/T两态,激发态,单线态与三线态,Mg的基态与第一激发态,基态,1st激发态,3s,3p,内量子数J有2S+1个取值 (L+S),(L+S-1),(|L-S
2、|),L= 0 (用S表示) 1(用P表示) 1 J= 0 1 2, 1, 0,光 谱 项,改变自旋/禁阻/磷光,5.1.1 产生,13:33:29,去活化,5.1.1 产生,13:33:29,去活化,不论开始处于哪个激发S态最后到达S1最低振动能级,5.1.1 产生,13:33:29,去活化,室温无磷光,5.1.1 产生,13:33:29,去活化示意图,5.1.1 产生,13:33:29,去活化演示,e,e,吸收,驰豫,e,e,5.1.1 产生,13:33:29,去活化演示,e,内部转换,e,荧光,e,5.1.1 产生：过程,荧光的产生,e,e,e,e,5.1.2 激发光谱与发射光谱,变入射
3、光波长，荧光最强处测If,本质：吸收光谱,固定激发光，测Ift 关系,本质：荧光发射光谱,用于选择条件，可组成两维光谱,1、激发光谱荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。,2、发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。,3、荧光发射光谱的普
4、遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 （3）镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。,三、荧光和分子结构的关系,分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光； 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。,1、量子产率荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力。在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每
5、一个过程的速率常数有关。凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常， kF 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。,提高kf，降低ki 都可增强荧光 分析应用价值f0.1；荧光素的f1,2、荧光、磷光与有机化合物结构的关系1）跃迁类型：通常，具有*及n*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具*跃迁的量子效率比n*跃迁的要大得多（前者大、寿命短、kISC小）。 2）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。 3）刚性结构：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素（大）与酚酞（=0）；芴（=1）与
6、联苯（ =0.18）。 4）取代基： 给电子取代基增强荧光（p-共轭），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等； 吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等； 重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该 现象也称重原子效应。,内因,联苯 芴,酚酞 荧光素,2，2-二羟基偶氮苯 形成配合物后有荧光,环境因素溶剂：激发态比基态极性大，溶剂极性增，则荧光红移并增强奎宁在苯:乙醇:水1:30:1000温度：影响非常大。辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大。磷光影响更大。pH： 本身为弱酸碱物质时影响大 p94其他：表面活
7、性剂增强，溶解氧(增大系间跨跃)降低,分子结构首要条件有吸收，含共轭双键，通常1个苯环增大共轭 奈f=0.29， f=310nm蒽f=0.46， f=400nm刚性平面结构 芴f1.0； 联二苯f0.2 减少振动和碰撞去活；鳌合物荧光的原理 ，见p92给/吸电子基增/减荧光，卤素重原子效应大减 p92,有利因素 增大共轭 刚性结构 给电子基团,5.1.3 影响因素,5.1.3 影响因素,猝灭效应 (1) 碰撞猝灭及能量转移：主要/外部转换热效应溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降。,(2) 氧熄灭：顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态,粘度大 温度高 ,(3) 自熄灭/自吸收自熄：浓
8、度高时，激发态之间相互碰撞自吸：荧光曲线与吸收曲线重叠时，被基态分子吸收,低浓度！,5.1.4 定量关系,泰勒级数展开,常A0.05,If与A 的关系 A与c正比，低浓度,5.1.5 荧光仪,光源,单色器1,样品池,单色器2,检测器,放大 与 记录,垂直方向,5.1.5 荧光仪,与分光光度计的主要差别, 垂直测量方式, 消除透射光影响, 两个单色器，激发和发射，常用光栅,光源：高发射强度。常用氙灯。,高灵敏度原因：测量I非A， 提高激发光强度，现代技术测弱光信号,确定量子效率,13:33:29,5.1.5 荧光仪,试样室：四面光石英池固体试样架,四面光比色皿,色散系统：光栅第一单色器选激发光波
9、长第二单色器选荧光波长,5.1.6 实验技术与应用, 时间分辨技术, 各发光体的发光衰减速率不同,光谱重叠，发光寿命不同的组分可分辨与测定。,对门控时间扫描，测Ift，测定荧光寿命。,根据不同发光体形成速率，消除干扰。,Th 0.01g,Zr 20g,Al 100g,5.1.6 实验技术与应用, 同步扫描技术,固定波长差，简化荧光光谱，提高选择性。,Zr 20g,酪氨酸和色氨酸：荧光光谱严重重叠60nm, 则显示色氨酸光谱,丁省普通荧光,丁省同步荧光,激发,发射,5.1.6 实验技术与应用, 应用,无机物：已有70种元素可分析。鳌合物法：Be Al B Ga Se Mg与荧光物质缔合猝灭法：F
10、 S Fe Ag催化荧光法：Cu Be Fe Os H2O2有机物：简单有机物与其他有机试剂作用后产生荧光芳族通常可直接测定,灵敏度：比光度法高23个数量级,5.1.6 实验技术与应用, 荧光干扰峰 倍频峰在激发波长ex的n倍处有荧光发射光谱,苯丙氨酸phe，ex=257nm， n=1,2处有峰， 强度不随浓度变化,ex=257nm,荧光分析：应避开ex光的n倍处,5.1.6 实验技术与应用, 仪器实物 www.PerkinE,LS45,LS55,本系仪器简介,5.2.1 产生与光强,5.2 磷光Phosphorescence,T1S0 禁阻跃迁，速率小，寿命长非辐射概率增大，导致Ip小,磷光
11、：波长更长/寿命更长,5.2.2 温度影响,室温下，T1分子与溶剂碰撞失活，几乎无磷光,液氮中，强荧光。低温磷光分析,室温磷光,5.2.2 温度影响,室温磷光,胶束稳定,固体表面,敏化溶液室温磷光,e,S0,S1,合适的受体A,e,待测物D是能量供体,吸收激发,体系间跨跃S 1 T1,T1,能量转移D* A*,e,e,磷光产生A* A+hv,S0,T1,受体A的选择： (1)在供体激发波长范围内，摩尔吸光系数较低 (2)T1能量略低于供体D的T1 (3)量子产率大。常用有1,4-二溴萘,5.2.3 重原子效应,提高Ip:用含重原子的溶剂(碘乙烷)分子中引入重原子 internal heavy-
12、atom effect称为(内外部)重原子效应,高核电荷使电子能级复杂，电子自旋-规定耦合作用加强S1T1增加,引入重原子,荧光增强吗?,顺磁性物质，氧等,5.2.4 仪器,与荧光仪一体化,试用室:试样池放在液氮杜瓦瓶内固体表面磷光需特制试样室,磷光镜:一种机械切光装置.转筒式和转盘式时间分辨技术, 去荧光,5.2.4 仪器,磷光仪中的2种机械切光器,5.2.4 应用,与荧光法互补用于药物/临床/环境分析,低温法:多环芳烃, VK, VB6, VE,固表法: 一种机械切光装置.多环芳烃, 杂环化合物,5.3.1 概述,化学反应产生激发态分子, 光发射。用于痕量元素、环境检测、生物医学分析。与荧
13、光法互补。,5.3 化学发光Chemiluminescence,特点： 灵敏度高。鲁米诺体系测定Cr3+等检测限10-9 g/L, 线性范围宽：56个数量级, 设备简单：无光源，无需单色器，测发光总量 快速,5.3.2 原理, 某种反应产物接受反应能而激发，辐射放能,A + B C* + D C* C + h 快速释放足够能量(Redox具有过氧化物中间产物的氧化反应)激发态分子能辐射跃迁, 发光效率与强度生物发光效率高，非生物发光常0.01，根据确定时间内的发光总强度定量分析, 鲁米诺体系许多金属离子有催化,5.3.2 原理液相示例,鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)体系,max=425nm 可检
14、测10-9 mol/L 的H2O2 过渡金属催化此反应, 发光大大增强。测Co(II)/Cu(II)/Ni(II)等 0.0140 g/ml,生化反应测氨基酸AA O2 酮酸 H2O2 NH3 鲁米诺 h,5.3.2 原理气相示例,氮氧化合物化学发光,波长范围600 875nm 检测限1 ng/ml。可用于测NO或O3 可间接测定NO2 (还原为NO)和NH3 (高温氧化为NO2 ) 测量汽车尾气中NOx,5.3.2 原理火焰化学发光,NO在富氢火焰中燃烧,max=690nm 而NO2 能迅速被还原为NO, 因此可测NOx总量 据此原理可作色谱的氮化合物检测器,六、荧光试剂的设计合成及应用 1
15、、检测和造影一氧化氮的新型邻苯二氨BODIPY荧光探针的研究及应用,NO的直接荧光光度、高效液相色谱与细胞成像分析新方法,探针的合成路线,探针与NO的反应,荧光生成试剂：自身荧光极弱，在生理环境下只与NO反应，生成强荧光的三氮唑,Anal. Chim. Acta, 2003, 419, 169,荧光光度法直接检测NO释放,线性范围 0.010.4M 检出限 2.5 nM,超声波辅助液相微萃取结合HPLC检测细胞NO释放,（2005)个 PC12 细胞NO释放的色谱图 a: TMDCDABODIPY-T. b：TMDCDABODIPY,单个PC12细胞释放NO的速度为1.76 fmol / 30
16、 min,J. Chromatogr. A, 2006, 1103, 193,高效液相色谱分离荧光检测血液中的NO,线性范围 8.010-10-8.010-7 mol/L 检出限 210-11 mol/L,Anal. Chim. Acta, 2003, 419, 169,TMDABODIPY 和 NO衍生物色谱分离图 ex/em = 498 nm/507 nm (a) TMDABODIPY-T (b) TMDABODIPY,Fluorescence intensity (arbitrary units),Bright-filed and fluorescence images of PC12
17、cells (activated with 12.5g/mL LPS) loaded with TMDCDABODIPY in the presence of L-Arg (1 mmol/L),BODIPY探针细胞造影检测NO,论文已为Nitric Oxide接受,单胺类神经递质、肽的毛细管电泳和高效液相色谱分析新方法,2、含N-琥珀酰亚胺羧酸酯反应基团的BODIPY、荧光素等荧光探针研究及应用,SAMF,SIFA,TMPAB-OSu,荧光素-O-乙酸酯,SIFA,目前测定氨基化合物灵敏度最高HPLC 荧光 检出限：达amol级CELIF 检出限：zmol级,SIFA衍生HPLC分离测定九个脂
18、肪胺的色谱图,J. Chromatogr. Sci., 2001, 39, 365,6-O-(1-琥珀酰亚胺基)氧酰基甲基荧光素甲酯,SAMF,荧光量子产率在pH4-6大于荧光素，且在pH4-9保持恒定，为0.32,光稳定性好,Electrophoresis, 2006, 27, 827-836 Electrophoresis, 2005, 26, 1954-1962J. Chromatogr. A, 2005, 1063, 143-151,四甲基BODIPY琥珀酰亚胺酯,TMPAB-OSu,荧光量子产率高0.78，可与荧光素媲美，且不受溶剂和pH影响 激发、发射波长 500 nm，不受生物背
19、景干扰 光稳定性好,Anal. Chim. Acta, 2006, 575, 255-261 Talanta, 2006, 69, 1190-1199,小分子巯基化合物如谷胱甘肽、高半胱氨酸等高效液相色谱及直接荧光光度分析新方法,3、荧光检测含巯基生物活性物质的新型碘乙酰胺类及马来酰亚胺类荧光探针的研究及应用,碘乙酰胺类荧光分子探针,3-碘乙酰胺基苯并蒽酮,1.谷胱甘肽 2.半胱氨酸 3.高半胱氨酸 4 .N-乙酰半胱氨酸,3-碘乙酰胺基苯并蒽酮HPLC分离测定巯基化合物,Anal. Chim. Acta, 2004, 512, 281,克服了以往马来酰亚胺类荧光探针作为衍生试剂，生成的衍生物在色谱图上有多重峰的缺点，有效提高了巯基化合物测定的选择性和灵敏度,马来酰亚胺类荧光分子探针,谷胱甘肽、半胱氨酸的直接荧 光光度分析新方法,荧光生成试剂,5-马来酰亚胺-2-(间甲基苯基)苯并噁唑,探针与巯基化合物的反应,分子探针与检测试剂 科学出版社，2002年，47.5万字,参考书目,本章作业,思考题： P99 （1，2，3，4）作业：P99（5，6，7）,
