1、乙酰胆碱酯酶酶活的测试作者：陈志坚1 准备工作0.1mol/L pH=8.0 的磷酸缓冲液：NaH 2PO4 1.68g，Na 2HPO4 12.21g 溶于 1L 水。2 酶液制备SD 大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液 ( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积 1:10 的比例，稀释混匀。将制备好的 10%脑匀浆以 300
2、0r/min 离心 15min，取上清液待测。3 酶活性抑制测试3.1 配药液参照脲酶实验3.2DTNB 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh 碘化硫代乙酰胆碱0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH3.3 酶活测试在 3.00ml 磷酸盐缓冲液 (0.lmol/L,pH=8.0)中加入 20uL 酶液 ,混匀后 37保温 20min 后,依次加入 100ulDTNB 溶液(终浓度 1.0mmol/L)和 20uLATCh 溶液(终浓度 1.0mmol/L),充分混合,反应体积为 3.14mL。在 412mn 处用 1cm 比色皿，每隔 0.5min 读数,连
3、续测定 3min。酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的 umol 数。这是未加药酶活力为 E1。在 2.98ml 磷酸盐缓冲液 (0.lmol/L,pH=8.0)中加入 20uL 酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次） ，依次加入 100ulDTNB 溶液(终浓度 1.0mmol/L)和 20uLATCh 溶液(终浓度 1.0mmol/L),充分混合,反应体积为 3.14mL。在 412mn 处用 1cm 比色皿，每隔 0.5min读数, 连续测定 3min。计算出此时酶活，为 E2。抑制率计算公式为 I（%）=(E1-E2)/E1*100%得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用 SPSS 计算出药物的 IC50。
