1、实验二、 RNA提取及RT-PCR,实验内容1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收,实验一. 提取小鼠肝脏组织的RNA,一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3poly(A)尾巴结构 20-200个A. 翻译所必需。起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15%3、rRNA: 80-85%大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18
2、S=1874nt,二、RNA提取的注意事项,RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、 尽量避免外源性RNase 污染A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C. 一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。,RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。,1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操
3、作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1 mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。,三、RNA提取的实验操作,播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项,1、异硫氰酸胍法：GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol 试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总
4、RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,RNA提取的几种方法,室温孵育10 min介绍,RNase抑制剂,1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。2、肝素：
5、 使用浓度：0.110mg/ml效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制效果。,5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。6)10000 rpm， 离心 5 min,7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。,有声课件2: RNA干燥及溶解技巧,8) 沉淀RNA：加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。10, 000rpm，4C，离心10 min弃上清。) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10) 7500rp
6、m，4C 离心 1 min，弃上清再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。,用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。 当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。,11)室温干燥35 min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）,注意事项：,RNA:避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。,RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明,
7、12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳). 14) 剩余 9 l溶液,放到冰上备用（将用于RTPCR）.,注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。,避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度： 吹打时液体流动不拐弯为止。,实验二. RNA 的琼脂糖凝胶电泳,基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用
8、非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解,RNA 的琼脂糖凝胶电泳,RNA样品： 4.5 l上样缓冲液： 1 l混匀后， 5.5 l 直接电泳上样（100伏，1030分钟）上样前预电泳5min。,注意: 电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果,RNA的电泳上样：,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取
9、成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。,分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。,RNA电泳结果分析,实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR),逆转录酶：存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。,逆转录反应原理,mRNA,3-TTTTTT(18)-5,68-70oC, annealing,3-TTTTTT(18)-5,37-42oC, RTase,mRNA,mRNA,
10、cDNA,10min,1-2h,逆转录,有声课件3: RT 的原理和注意事项,总RNA 9 lOligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65水浴10min，立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。,第一步： 打开RNA链之间的二级结构，使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。,5RT-buffer 4 lRNasin (RNA酶抑制剂，40U/ml) 1 ldNTPs (10mmol/L) 4 lAMV （逆转录酶） 1 l轻弹管底混合。置42 oC 水浴1h。,第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂,第三步：将上述反应移至
11、68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用,午 休, PCR反应体系的建立 PCR 反应的进行 PCR产物的电泳 结果观察与分析 PCR产物回收,实验操作内容,有声课件,（1）： PCR的基本原理及反应体系的组成 PCR反应动画,目的基因片断的体外扩增,（2）：PCR 反应条件的确定及PCR常见问题的解决方案,1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l 2）加入下列试剂,，顺序可以改变10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 ldNTPs (10mM) 1 l3 引物 (10mol/L) 1 l5 引物 (10mol/L) 1 l 3）加去离子水 ，补足5
12、0l最终反应体系 4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 1 l,实验操作一、建立 PCR 反应体系,3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。,取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中，用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂：,注意： （1） PCR相关试剂均放在每排实验台上方中间位置处的蓝色 圆盒中（2）加样的体积要准确，1 l 的体积不应该超过白色枪头的第一个格。,实验操作二、 PCR 反应的进行,1、将样品放入 PCR 仪中,2. PCR反应条件,94 3
13、0 S DNA变性 (Denaturation)55 30 S 退火 (Annealing)72 45 S 延伸 (Extension)上述温度变化进行 30 个循环 (cycles) 。72 10 min (Further extension)。,3. 将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。其它同学课间休息。,播放：有声课件 （PCR讲解1）,播放：有声课件 （PCR讲解2）,播放：PCR 动画,实验操作 三、 PCR产物的电泳,1. 教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。,2. 样品制备：在50 l PCR产物中，加入 6 ul 上样液，混匀。（上样液：10Loading bu
14、ffer 或 6Loading buffer） 3. 上样： 将上述样品加入凝胶加样孔中。注意：DNA Marker。 4. 电泳：100 伏，30分钟。,操作四、PCR产物的电泳结果观察及分析,GAPDH gene 片段 (746bp),750bp,2000bp,1000bp,500bp,250bp,100bp,Marker 1 2,（2）此PCR 结果存在什么问题？,原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？,？,？,（1）观察： 蓝色箭头指示的是何种DNA ？,GAPDH gene 片段 (746bp),750bp,2000bp,1000bp,500bp,250bp,100bp,Marker 1 2,挤胶法回收PCR产物：,（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中； （2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20冰箱中 。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。,PCR电泳结果,实验操作五、PCR产物的回收,思考题：,PCR反应的第几个循环开始出现符合预期长度的目的DNA片段？请画图说明。 用Taq DNA聚合酶进行PCR时，获得的PCR产物的末端都有哪些情形？T-A连接的原理是什么？影响连接效率的因素有哪些？,实验结束后整理实验台, 值日生值日!,
