1、第十一章 核酸的生物合成,nucleic acid biosynthesis,本章主要内容,DNA的生物合成 RNA的生物合成,基 因 (gene)：为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。 基 因 组（genome)：某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。,转录：遗传信息从 DNA传递给mRNA的过程。,基因表达：是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质。,翻译：mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程。,中心法则（ central dogma）,1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。,主要内容 D
2、NA的生物合成 复制 RNA的生物合成 转录,第一节 复制的基本规律,半保留复制 复制起始点 双向复制 半不连续复制,DNA复制的基本原则,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,一 半保留复制的概念,半保留复制 semiconservative replication,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TC
3、TTGAATC,亲代,子代,DNA半保留复制实验,含N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,DNA半保留复制的实验,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、复制的起始点和方向,复制起始点：染色体上固定的位置，由100200个碱基对组成的一段DNA。方向：单向或双向复制复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉,复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉。,原核生物：基因组是环
4、状DNA：只有一个复制起始点 DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。,ori,oriC,真核生物： 染色体DNA有多个复制起始点。 两个起始点之间的DNA片段称为复制子。 复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,真核生物的多复制子复制电镜图,三 半不连续复制（semidiscontinous replication),领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为前导链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链。
5、 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 原核生物: 10002000个核苷酸 真核生物: 100200个核苷酸,半不连续复制动画,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,DNA复制的体系底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)模板: 解开成单链的DNA母链引物: 提供3-OH末端的RNA短片断其他酶和蛋白质因子
6、: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,一、 复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二 DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖,奥乔亚 科恩伯格Severo Ochoa Arthur Kornberg,聚合反应机理,聚合反应的特点 以单链DNA为模板 以dNTP为原料 引物提供
7、3-OH 聚合方向为5 3 遵守碱基互补规律,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,校读、修复合成、切除引物填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E. Coli中的DNA聚合酶,功能：校读，去除RNA引物
8、，填补空隙，参与DNA损伤修复。,DNA-pol ,DNA聚合酶II (DNA-pol II) 具有53的聚合酶活性。 只是在无pol及pol的情况下暂时起作用。 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA聚合酶III (DNA-pol III) 是复制延长中真正起催化作用的酶。 由10种亚基组成不对称的聚合体。 ，亚基组成核心酶，亚基具有53的聚合活性，亚基具有35外切酶活性， 亚基可能起组装作用。,亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。 其余亚基统称为-复合物, 是DNA夹子加载蛋白。,DNA-pol ,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol
9、 ,起始引发，有引物酶活性。,复制的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三 复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA
10、复制的保真性至少要依赖三种机制,（二）复制的保真性和碱基选择,四 复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一） 解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,（二）
11、 DNA拓扑异构酶(DNA旋转酶）,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 克服解链过程中的打结、缠绕现象,拓扑异构酶拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）,作用机制,解旋解链酶类的作用,解链酶,DNA拓朴异构酶,单链DNA结合蛋白 SSB,解开、理顺 DNA链、维持DNA单链状,（三） 引物酶(primase),依赖DNA的RNA聚合酶。 可以催化游离
12、NTP聚合。 催化RNA引物的生成。,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP（NAD+）,AMP,5,3,5,3,在复制中起接合双链中单链缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的功能,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物
13、的DNA生物合成,DNA解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引物体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引物体。,DNA复制示意图,拓扑异构酶,解链酶,5/ 3/,3/ 5/ 3/ 5/,DNA聚合酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,前导链 随后链,DNA连接酶,冈崎片段,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐
14、个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,E.coli,ori,ter,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,DNA的复制过程,模板DNA解旋与解链，形成复制叉； 形成引发体，合成RNA引物； 按A=T、G=C碱基配对规则，合成DNA； 切除引物、填补空隙； DNA连接酶连接封口，形成长链DNA；,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other D
15、NA Replication Ways,第四节,逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录酶 (reverse transcriptase),从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶。 有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性（水解RNA-DNA杂交链）DNA指导的DNA聚合活性,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,突变 (
16、mutation)：是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。DNA损伤 (DNA damage)： 泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,自发性: 自然错配率约为10-910-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致
17、癌剂。 生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。,物理因素,化学因素,常见的化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,BU,A,5,-,BU,G,-,A,-,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类，,Nitromins,G,m,G,G,m,G,DNA,缺失,G,四、DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(ligh
18、t repairing) 切除修复(excision repairing),修复的主要类型,（一）光修复,光复活酶,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA聚合酶,OH,P,DNA连接酶,NAD+,E.coli的切除修复机制,基因克隆,克隆 DNA克隆 PCR 基因克隆的基本原理,RNA 生物合成 (转录),第六节,转录（transcription） 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录,DNA,转录与复制的相似点：1. 模板均为DNA；2. 延长机理都是形成磷酸二酯键；3. 方向均为53。,转
19、录和复制的区别,参与转录的物质,原料: NTP（ATP, UTP, GTP, CTP） 模板: DNA 酶: RNA聚合酶（RNA polymerase, RNA-pol） 其他蛋白质因子,第一节 转录的模板和酶 Templates of Transcription and Enzymes,一、转录模板,能转录出RNA的DNA区段,模板链 (template strand),编码链 (coding strand),编码链,模板链,双链DNA分子中能作为模板转录出RNA的那条链，称为模板链。又叫有义链。另一条互补链称为编码链，又叫反义链。对转录起调节作用。,转录产物RNA的碱基序列，除了 T 变
20、U 外，其余与编码链相同。,不对称转录(asymmetric transcription) 在DNA分子双链上某一区段，一股链可转录，另一股链不转录； 模板链并非永远在同一单链上。,二、RNA聚合酶（DDRP）1. 原核生物的RNA聚合酶E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的六聚体（ 2 ）,2 ,E. coli RNA聚合酶组分,其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。原核生物的 RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的亚基特异结合，从而影响酶的活性。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2. 真核生物的RNA聚
21、合酶,RNA聚合酶、都由多个亚基组成。有些亚基是三种酶所共有。这些聚合酶都有类似的起始因子和与E. coli RNA聚合酶类似的RNA链延伸方式。对DNA的终止子所知甚少。,三、酶与模板的辨认结合RNA聚合酶结合模板DNA的部位称为启动子(promoter)。是调控转录的关键部位。,第二节 转录过程 The Process of Transcription,分为三个阶段：起始(initiation)延长(elongation)终止(termination),一、原核生物的转录过程,（一）转录起始1. RNA聚合酶结合在转录模板的起始区域。2. DNA双链解开，以一条链为模板，合成第一个磷酸二酯
22、键。,2. DNA双链解开。,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合。,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + PPi,转录起始过程,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物,（二）转录延长,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,转录的起始及延长过程,(三) 转录终止RNA聚合酶在DNA模板上停顿下
23、来，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,依赖Rho ()因子的转录终止,第三节真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification,一、mRNA的转录后加工(一)首尾的修饰1. 5-端加帽:m7GpppG(甲基双鸟苷三磷酸)2. 3-端加尾：多聚腺苷酸 (poly A)聚合酶催化,帽子结构,5 pppGp,5 GpppGp,pppG,PPi,鸟苷酸转移酶,5 m7GpppGp,甲基转移酶,SAM,帽子结构的生成,5 ppGp,磷酸酶,Pi,加帽过程,（二）mRNA的剪接,hnRNA许多极长RNA分子构成的混合物。 是细胞质mRNA的前体。,真核生物结构
24、基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),非编码区 AG,编码区17,2. 外显子(exon)和内含子(intron),外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,Unit of transcription in a DNA strand,Transcript modification,3,5,3. mRNA的剪接, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,二次转酯反应,二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,连接酶,tRNA核苷酸 转移酶,碱基修饰,三、rRNA的转录后加工,5.8S和28S-rRNA,rDNA,内含子,内含子,28S,5.8S,18S,45S - rRNA,
