1、荧光分析原理讲座 实验室仪器培训课,主讲：贺全国博士,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,2,1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。,一、 分子荧光与分子磷光分析法发展,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,3,二、荧光原理(雅布伦斯基图 ),荧光寿命: 109107 s 磷光寿命: 10410 s,分子吸光与发光示
2、意图,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,4,Jablonski Diagram,Absorption,Intersystem crossing, ISC, 10-210-6 s,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,5,蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）,激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:ex,发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,6,荧光分析法测定血清中的镁,镁-Oxine的激发光谱和发射光谱,/,2019/
3、6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,7,荧光光谱的特点,Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系.,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,8,三、荧光定量分析的基础 荧光强度(F/I )与物质浓度(c)的关系,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,9,在稀溶液中：F2.3Kb cI02.3KAI0 荧光物质的荧光效率(量子产率)： 荧光物质的吸光系数b液层厚度I0入射光强度K检测效率（由仪器决定）,当b，I0
4、一定时： FKc,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,10,一般当b c 0.05 时, F 与c呈线性关系,高浓度时，荧光物质发生自熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,11,四、 荧光与分子结构的关系,1.共轭效应 * 跃迁芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,12,2. 刚性结构和共平面效应,酚酞(无荧光),8羟基喹啉(弱荧光),红色荧光,荧光黄,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应
5、用湖南省重点实验室,13,联二苯 = 0.2,芴 = 1.0,3,4-苯并芘,( 强荧光物质),2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,14,3. 取代基的作用,给电子基增强荧光：OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN 吸电子基减弱荧光：COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I与体系作用小的取代基影响不明显：SO3R,NH3,SH,F,R。,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,15,取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,16,五、 影响荧光强度的主要因素
6、,1. 浓度：稀溶液，Fc (bc0.05) 2. 光源： FI0 ， 应强度大，稳定。,3. 温度：T 低，增加。荧光素钠的乙醇溶液, T0时,每降低10, 增加3%, -80 时=100% .,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,17,六、荧光光度计及荧光测定方法,荧光光度计示意图,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,18,荧光仪部件,激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光，常用氙灯、高压汞灯或激光光源. 样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两个光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的
7、方向检测荧光.,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,19,荧光光度计光路图,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,20,测定方法标准曲线法,1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)； 2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线计算荧光物质的浓度.,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,21,七、 荧光分析法的特点和应用,灵敏度高：测定下限0.10.001 g/mL,比分光光度法高24个数量级。 （在黑背景下检测；光源的强度大
8、）选择性高： 适当选择激发光的波长和荧光测定的波长； 应用荧光寿命的差别 时间分辨技术。,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,22,荧光测定的选择性,蒽的激发和发射光谱,菲和蒽的荧光光谱 （激发波长 265 nm),菲在360 nm以上无吸收，用365 nm激发光时，菲无荧光，可以在400 nm测定蒽的荧光。在265 nm, 蒽和菲均有吸收，以此波长的光激发，在350 nm只有菲有荧光，故可测定菲。,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,23,MFS与UV/Vis 法比较：,原理 UV/Vis 吸收 MFS 发射,2019/6/16,绿色包
9、装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,24,荧光光度法的应用,生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质.带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质.荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧光络合物。 荧光熄灭法测定猝灭剂Ni2+对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（ 610-5 610-3 gmL-1）,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,25,N,OH,8羟基喹啉(Al,Be等),茜素紫酱
10、R(Al,F-等),用于测定无机离子的有机试剂,黄酮醇(Zr,Sn等),2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,26,举例 痕量3,4-苯并芘的测定:,萃取（环己酮或石油醚）浓缩层析 以H2SO4 溶解苯并芘荧光分析,荧光测定：ex = 520 nmem= 545 nm,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,27,八、 磷光分析法,获得较强磷光应采取的措施：1. 低温，,禁阻跃迁,几率小;系间窜跃,寿命长.,磷光分析仪器 液槽：石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶. 斩波片：在激发光单色器与液槽之间以及在发射光 单色器与液槽之间各装一个斩波片.,应用：主要用于有机分析, 与荧光法互补.,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,28,室温磷光-固体样品 低温磷光-液体样品,低温磷光的样品装置,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,29,转筒式磷光镜（a）和转盘式磷光镜（b）,2019/6/16,绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,30,大家多努力! 谢 谢！,
