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类型实验八 紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度.doc

  • 上传人:精品资料
  • 文档编号:8231168
  • 上传时间:2019-06-15
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    实验八 紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度.doc
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    1、实验八、紫外吸收法检测 DNA 的浓度与纯度一、实验目的学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度,从而测出 DNA 的浓度与纯度。二、实验原理DNA 的吸收峰在 260nm,蛋白质的吸收峰在 280nm。1 g/ml 标准 DNA 样品 A260=0.02,因此,A 260=1 时,双链 DNA含量为 50g/ml;单链 DNA 与 RNA 含量为 40g/ml;寡聚核苷酸的含量为 30g/ml。一般来说,纯净的 DNA 其 A260/A280的比值约为 1.8,大于 1.8 表明样品中 RNA 污染严重,小于 1.6 说明有蛋白质或苯酚污染;纯净的 RNA A260/A280的比值约为 2.0

    2、,在样品中若含有蛋白质,会使A260/A280的比值下降。三、实验材料紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒 DNA四、实验步骤1、选取合适的按键。待测定样品为 dsDNA(如 PCR 产物) ,按下键“7/dsDNA” 。待测定样品为 ssDNA(如反转录合成的第一链 cDNA 产物) ,按下键“8/ssDNA”。待测定样品为 RNA,按下键“9/RNA” 。待测定样品为 Oligo(如 PCR 引物) ,按下键“6/Oligo” 。2、将空白对照置入样品孔。注意:空白对照是空白液,并非所有情况都是水。例如,用 Tris 溶液溶解 DNA 样品,则要用 Tris 液做空白对照。3

    3、、按下 “Blank”键。仪器记录空白对照,设置为 0.000A。4、将样品置入样品孔,按下“Sample”键,仪器显示样品的吸光度和浓度值,以及其他相关参考比值。五、实验结果与分析A260/A280=1.118,DNA 浓度 86.45。A260/A280小于 1.6,说明蛋白质或苯酚污染严重,这可能是在制备质粒 DNA 时加入的酚/氯仿不足,或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因。DNA 浓度偏低,可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗。六、思考题问:利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低?为什么?答:核酸在波长 260 nm 处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分 DNA 和 RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量,故结果偏高。

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