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类型小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数.doc

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    小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数.doc
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    1、 山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 1 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法,并对小鼠脾细胞进行原代培养;2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用;3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法;4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数;【实验原理】A. 细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下,把动、植物细胞从组织中取出,在体外模拟体内的生理环境,

    2、使离体的细胞在体外生长和繁殖,并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞,在无菌条件下,用胰蛋白酶消化或机械分散等方法,将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度,形成致密的单层细胞时,用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞,从一个容器中以 1:2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法,称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行

    3、观察和研究,则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料,对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律,探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制,也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性,使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段,被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点;培养条件易改变和控制,便于单因子分析;便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察;在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)

    4、已被广泛应用。细胞培养的局限性:在脱离机体复杂环境下,细胞培养条件与躯体环境有一定距离;观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况;细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境,最适温度、渗透压、气体条件、最适 PH、营养条件和培养基质等。B. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异: 细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目

    5、小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 2 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#选择性地通过;而细胞死后,细胞膜受损,其通透性增加。基于此,发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法,上述染料能使死亡细胞着色,而活细胞不被着色。此外,应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性,死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏,故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 代谢上的差异:活细胞中新陈代谢作用强,细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此,发展处了以荧光素二乙酸酯(FDA) 、荧光素二丙酸酯、荧

    6、光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法,上述酯化的荧光素亲脂性提高,容易被细胞吸收进入,活细胞内的酯酶具有较强的活性,可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素,该物质不能自由透过活的细胞膜,积累在细胞内,荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光;而死亡细胞内的酯酶因失去活性,不能分解酯化的荧光素,荧光显微镜下显示不发光。另外,可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力,能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型,故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色;死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞

    7、,因无还原能力或还原能力极弱,使亚甲蓝仍处于氧化态,故呈现蓝色或淡蓝色。C. 血球计数板的使用血球计数板是一块特制的厚载玻片,载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个方格网(如图 3)。每个方格网共分 9 大格,其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种:一种是大方格分为 16 个中方格,而每个中方格又分成 25 个小方格;另一种是一个大方格分成 25 个中方格,而每个中方格又分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即每个大方格都由 400 个小方格组成(图 4)。每个

    8、大方格边长为 1mm,则每一大方格的面积为 1mm2,每个小方格的面积为 1400mm 2,盖上盖玻片后,盖玻片与计数室底部之间的高度为 0.1mm,所以每个计数室(大方格)的体积为 0.1mm3,每个小方格的体积为 l4000mm 3。使用血球计数板直接计数时,先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。图 1 血球计数板的构造(a、平面图;b、侧面图)山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第

    9、3 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#【实验用品】1. 材料小鼠脾脏;2. 试剂PBS 缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红;3. 器材解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf 管(上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好) ;倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。【操作步骤】A. 原代脾细胞培养1) 取材:取小白鼠一只,采用断头法处死,清水洗净小白鼠并浸于 75%酒精中灭菌 3min,取出转入超净工作台内的解剖盘内,无菌操作打开腹腔,取出脾脏,去除周围的脂肪组织,镊起脾脏用 PBS 液自上而下冲洗 1-2 次,转入无菌

    10、玻璃培养皿中,待用。2) 分离脾细胞:用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入 PBS 液 30 滴,再用 L 形针头注射器在皿内吸取 PBS 液0.2ml,然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内,用针尖在脾脏上扎眼,并用 L 形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞,用滴管吸皿中的 PBS 液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞,稍微倾斜并静置 1-2min,吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入 Eppendorf 管,以 3000 转/分离心 1-2min。3) 培养脾细胞:图 2 血球计数板网格的分区和分格山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#

    11、科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 4 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#从超净工作台中区塑料培养皿一个,用“枪(1ml) ”加入细胞培养液 2ml,并在皿上做记号,待用。取上述离心后的 Eppendorf 管,在超净工作台内打开弃去上清液,用“枪(200l) ”吸取塑料皿中的培养液 400ul,加入弃去上清液的 Eppendorf 管中,用枪头吹匀管底的脾细胞,然后吸取200ul 脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中,混匀,然后放入 37二氧化碳培养箱中培养。B. 细胞死活鉴定台盼蓝法:1) 试剂配制:用生理盐水配置 0.4%台盼蓝染液,备用。2) 细胞悬

    12、液制备:将生长有贴壁型细胞的培养瓶(皿)中的培养液倒入干净试管中,向培养瓶(皿)中加入 0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 混合消化液 1-2ml,静置 3-5min,待见到细胞变圆,彼此不连接为止,弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中,用滴管轻轻吹打细胞,制成细胞悬液。3) 染色制片:取 0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中,加 1-2 滴(约 0.1ml)染液,混合,2min 后制成临时装片,镜检。4) 染色结果:死细胞染成蓝色,活细胞不着色。C. 用血球计数板进行细胞计数1) 染色计数:取上述步骤二所制备 0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中,加 1-2 滴(约 0.1m

    13、l)染液,混合 2-5min,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上,使悬液自然充满计数板小室(注意:不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加;在普通光镜 10物镜下计数四个大格内的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右) 。2) 根据染色结果计算活细胞率:依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数,以如下公式计算细胞存活率: %10-%细 胞 总 数死 细 胞 数细 胞 总 数)活 细 胞 率 (【实验结果】A. 细胞原代培养结果:山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实

    14、验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 5 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#B. 细 胞死活鉴定结果:C. 细胞计数结果:用血球计数板计数,分别计算了红细胞计数区域的五个小方格,计数结果如下:项目 1 2 3 4 5细胞总数 11 14 11 20 18活细胞数 1 3 2 4 3每个中格平均细胞总数为 14.8平均活细胞数为 2.6活细胞率=活细胞数/细胞总数100%=13/74100%=17.6%细胞密度=大方格中细胞数10000稀释倍数=14.8161000010=2.37107/ml在倒置显微镜下,原代培养的细胞清晰可见,细胞聚集于培养液中,多呈圆形,形状规则,细胞

    15、质均匀。培养液由于未被杂菌污染而呈粉红色,无异味。图 1 倒置显微镜下细胞原代培养图示(10 40)经台盼蓝染色后,死细胞由于其细胞膜失去选择透过性而被染成蓝色经台盼蓝染色后,活细胞由于其细胞膜具有选择透过性而未被染成蓝色图 2 台盼蓝染色后死活细胞所呈状态(10 10)山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 6 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#【注意事项】1、 小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡 3min,防止杂菌污染无菌操作台;2、

    16、为近一步保证无菌操作台的无菌环境,可在玻璃挡板口点一酒精灯,一般操作都在酒精灯火焰旁操作;3、 取小鼠脾时注意保持其完整,注入缓冲液要慢而准且适量,不要撑破脾脏,保证细胞分散游离出来,也不能使游离的细胞中含有块儿状物质;4、 培养液 PH 为 7.07.4,其中加有酚酞,正常状况细胞生长过程代谢物使 PH 下降,培养液的颜色改变呈黄色,因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况;5、 生长状况良好的细胞膜和核完整,细胞质透明,而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形,折光率高,而衰退期细胞皱缩,透明度下降,立体感很差,较易区分;6、 倒

    17、置显微镜将物镜与载物台间的空间解放,可以允许连同培养皿一同观察。【思考题】1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法1) MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂,生成蓝色的formazan 结晶,formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT 还原) 。还原生成

    18、的 formazan 结晶可在含 50%的 N,N-二甲基甲酰胺和 20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解,利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。MTT 粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。步骤:a) 接种细胞用含 10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔 100010000 个细胞接种到 96 孔板,每孔体积 200ul。b) 培养细胞同一般培养条件,培养 35 天(可根据试验目的和要求决定培养时间) 。c) 呈色培养 35 天后

    19、,每孔加 MTT 溶液(5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育 4 小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。d) 比色选择 490nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 7 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#2)NCI 所用

    20、的体外化疗药物筛选法简单地说,NCI 的体外化疗药物筛选系统由 60 种不同的人体肿瘤细胞株组成,测定每个受试化合物在一定浓度范围抑止各肿瘤细胞的生长的能力或细胞毒性程度。以常规采用的筛选试验为例,在实验开始前一天,所有 60 种肿瘤细胞株细胞先接种在 96 孔细胞培养板上,然后将受试化合物 10 倍梯度稀释,一般最高浓度采用 104mol。每种化合物试验 5 种不同浓度。样品加入细胞悬液后培育 48 小时。此后用细胞染色法测定细胞的生长曲线,用 sulforhodamine 染色,再测定吸光度用以估计细胞数目。根据比色结果画出 60 条剂量一反应曲线,然后计算出 50生长抑止浓度(GI50)

    21、 ,100生长抑止浓度(TGI)以及 50细胞死亡浓度(LC50) 。再将各细胞系的 GI50、TGI 和 LC50 汇总画出均数图,从此图可以大致看出该化合物对不同的肿瘤细胞株的抑止能力。然后用计算机进行计算、模拟、比较,评价受试化合物的特征是否与某一类已知化疗药物类似,从而推测可能存在的抗癌机制。据统计,NCI 到目前为止已筛选了近 460000 种化合物。用 NCI 体外化疗药物筛选系统得出的数据也可用于指导将来对主要化合物的改造,使化合物的药理及毒理性质更为理想。3)以分子生物学为基础的化疗药物筛选方法近年来,对肿瘤的分子生物学研究取得了很大的进展,这给化疗药物的发展提供了一些新的目标

    22、。现在已有许多采用 X 射线衍射、蛋白结晶、基因配对等方法来推断及设计抗癌药物。这些方法往往开拓了一些全新的途径,但其缺点是这些化合物不一定对肿瘤细胞有选择性。另外,这些化合物是否能进入肿瘤细胞也是一大问题。因此,任何采用非细胞系统筛选的化合物都必须经过细胞系统以及合适的动物模型的检定才能进入临床试验。4)经典的化疗药物筛选模型 1985 年 NCI 建立体外细胞筛选系统。在此之前,NCI 抗癌药物的筛选方法主要采用体内肿瘤模型来进行。将白血病细胞株 L1210 及 P388 植入免疫缺陷鼠体内,待肿瘤长成后再给予不同剂量的筛选化合物,然后观察所试化合物是否能抑制肿瘤细胞的生长,甚至使肿瘤细胞

    23、死亡、消失。然后再作计算分析,得出最小抑制剂量、中位抑制剂量、LC50 等指标;以这些指标作为衡量受试化合物的抗癌作用强度。这一方法的优点是得到的药物可穿过细胞膜以及某些生理屏障,缺点是所得到的药物仅对快速分裂的肿瘤(如白血病、淋巴瘤)疗效较好,而对实体瘤的治疗远不尽人意。针对这一问题, NCI 在 1985 年对抗癌药物的筛选过程作了如下重大改变:利用以肿瘤种类为指导的体外细胞筛选法取代体内筛选法;利用实体瘤细胞株取代白血病细胞株;用相对小量的原始材料用于初筛;重新强调利用生物实验指导天然物中具抗癌活性成分的筛选。体内实验的免疫缺陷鼠肿瘤模型现已不常用于药物的初筛,而常规用于对初筛所得的先导

    24、药物作进一步测试以观察评估化合物对不同的实体瘤的治疗作用。2. 诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法:用米托蒽醌、顺铂、羟基喜树碱、 高三尖杉酯碱诱导 Jurkat 细胞凋亡,并通过 Annexin V /PI 法检测细胞凋亡及细胞死亡比例,分析不同作用时间以及不同药物浓度对 Jurkat 细胞凋亡的影响。材料和方法山东大学实验报告 2012 年 4 月 29 日姓名 # 班级 生命基地班 学号 201000140# 同组者:#科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 组别 # 第 8 页 共 8 页 细胞生物学实验报告#材料Jurkat 细胞系由本实验室保存。顺铂(CDDP)

    25、为齐鲁制药有限公司产品、羟基喜树碱(HCPT)为黄石飞云制药厂产品、 高三尖杉酯碱(HHT)为杭州民生药业公司产品、米托蒽醌(MIT)为浙江瑞新药业公司产品;RPMI 1640 为 Invitrgen 产品;Annexin V FITC/PI 试剂盒购自晶美生物公司;贝克曼流式细胞分析仪 Elite EXP。诱导 Jurkat 细胞凋亡Jurkat 细胞在 5% CO2 孵箱培养至对数生长期,镜下计数为 1106/ml,加入 24 孔板,每孔 1 ml 细胞悬液。用无血清细胞悬液将顺铂、 羟基喜树碱、高三尖杉酯碱和米托蒽醌药物配制成 1 mg/ml 溶液;每组药物分别设 4 个浓度:12.5、

    26、25、50、100 g/ml;分别加入 24 孔培养板,作 3 个复孔。置于 5 CO2 孵箱培养。Annexin V/PI 流式双参数分析1-3分别于加入药物作用 2、4 和 8 小时,吸取培养细胞悬液,用 4预冷的 PBS 洗细胞 2 次,用 250 l 结合缓冲液重悬细胞,使其浓度为 1106/ml;取 100 l 细胞悬液,加 5 lAnnexin V/FITC 和 10 l 的碘化丙锭;混匀后室温避光孵育 15 分钟;用 PBS 洗涤 2 次,进行流式细胞仪(FACS)分析。Annexin V-FITC/PI 双参数进行调试,以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。图 1-5 横坐标表示荧光强度,纵坐标表示细胞数,图中两个峰中的左边峰表示阴性峰,右峰表示凋亡峰,右峰曲线下面积越大凋亡就越多。根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。统计学分析各组细胞凋亡率均取 3 个样本的均值,以 XSD 表示,多个均数的两两比较采用中国医学百科全书医学统计学统计软件包 PEMS 3.1 软件进行检验

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