1、2.4 原核生物和真核生物 DNA的复制特点,2.4.1 原核生物DNA的复制特点,大肠杆菌DNA复制起始点（OriC）保守序列分布图,OriCin E.colichromosomal DNA,2.4.1.1 DNA双螺旋的解旋,由大肠杆菌oriC复制起始点处引发的DNA复制过程,(1)单链结合蛋白（SSB蛋白）,T4噬菌体的32 kDa蛋白可以结合单链DNA，它还能使双链DNA在远低于解链温度时分开。 大部分原核SSB蛋白与DNA结合时还表现出协同效应：如第一个SSB蛋白结合到DNA上去的能力为1，第二个SSB结合能力则可高达103。 SSB蛋白的作用是稳定单链DNA。,(2)DNA解链酶（
2、DNA helicase）,大部分DNA解链酶都沿滞后链模板的53方向并随着复制叉的前进而移动，只有Rep蛋白沿前导链模板的35方向移动。 因此，Rep蛋白和其他DNA解链酶分别在DNA的两条母链上协同作用，解开双链DNA。,Replication of SV40 DNA,2. 4. 1. 3 复制的引发和终止,DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链，那么，新DNA的复制是怎样开始的呢？ 研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。滞后链的引发过程比较复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用
3、，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。,滞后链的引发过程由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质n、n、n、Dna B、C和I共同组成，只有当引发前体（preprimosome）把这6种蛋白质合在一起并与引发酶（primase）进一步组装后形成引发体，才能发挥其功能。 引发体在滞后链分叉的方向上前进，并在模板上间断性引发生成滞后链引物-RNA短链，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNase H降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。,链的终止需要Tus蛋白参与,当复制叉前移，遇到20
4、bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。,链的终止（Termination）,2.4.1.4 DNA聚合酶,大肠杆菌中主要有DNA聚合酶I、II、III。,表2-10 大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较,DNA聚合酶的共同点：,1、都以dNTP为底物。2、都需要Mg2+激活。3、聚合时必须有模板链和具有3OH末端的引物链。4、链的延伸都方向为53。 DNA聚合酶I不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有53核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。它也可用来除
5、去冈崎片段5端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。,DNA聚合酶II的活性很低，若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA的转化率计算，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是复制中主要的酶。目前认为DNA聚合酶II的生理功能主要是起修复DNA的作用。DNA聚合酶III包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。它能在引物的3OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。,2.4.2 真核生物DNA的复制特点,真核生物DNA的复制子被称为ARS（auto
6、nomouslyreplicating sequences），长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒。因此，人类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。,真核细胞中有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和。,DNA聚合酶的主要作用：DNA聚合酶主要参与引物合成。DNA聚合酶活性水平稳定，主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶是主要负责DNA复制的酶。DNA聚合酶的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。,The mechanism of telomere extension by telome
7、rase Reverse,2. 4. 3 DNA复制的调控（了解）,DNA链延伸的速度在同种生物的不同细胞中几乎是恒定的，只是复制叉的数量不同。迅速分裂的细胞具较多的复制叉，而分裂缓慢的细胞复制叉较少并出现复制的间隙。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和RNA。,ColEl质粒DNA的复制调控,ColEl是一个6646碱基对的小质粒，在宿主细胞内有2030个拷贝，其DNA的复制完全依靠宿主DNA聚合酶。质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA（RNA1），它们控制了起始DNA复制所必需的引物合成。,ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系,大肠杆菌染色体DNA的复制调控,染色
8、体的复制与分裂一般是同步的，但二者并不直接偶联。 在一定生长速度范围内，细胞与染色体的质量之比相对恒定。 复制子由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制体调节蛋白，复制起点与调节蛋白相互作用并启动复制。调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确定复制起始频率和复制方式。 复制起点有OriC和OriH两种。,真核细胞DNA的复制调控,细胞生活周期水平调控（限制点调控）：决定细胞停留在G1期还是进入S期(by Cyclins, Cdc(Cell Division Cycle) gene products)。染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。复制子水平调控：决定复制的起始与否，并且是高度保守的。,课外作业,DNA复制的生化机制。,
