1、1，转膜不充分/过转对于非小分子量尤其是大分子量（100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（30kd 就要注意了，15kd 尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察 marker 有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加 SDS 以防过转，抗体技术实验指南提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含 SDS 的。2，封闭时间不足这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温 24h，但 4 度过夜确
2、实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。3，抗体与封闭液有交叉。实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA 蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用 TBST 也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。4，抗原-抗体浓度过高一般 10min*3 次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。5，暴光时间过长降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。6，抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其
3、最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。8，抗体交叉反应，形成非特异性条带非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于wester
4、n 的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度会下降甚至为 0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。9，SDS 非特异性结合蛋白条带使用无 SDS 转膜液.10，封闭液有杂质颗粒（静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层）主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内） ，这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。
