1、植物组织 MDA 含量测定一、目的要求1掌握植物组织 MDA 含量测定的原理及具体测量步骤；2深化理解 MDA 与逆境和衰老的关系，理解植物组织 MDA 含量测定的意义；3了解膜脂过氧化、氧自由基和 MDA 形成的关系；4能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定 MDA 含量；5学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。二、实验原理植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞
2、死亡。膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde ，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一个常用指标，可通过测定 MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。MDA 在高温及酸性环境下可与 2-硫代巴比妥酸（TBA）反应，产生红棕色的产物 3,5,5-三甲基恶唑 2,4-二酮（Trimetnine），又名三甲川，该物质在532nm 处有最大光吸收，在 600nm 处有最小光吸收。由于 TBA 也可与其它物质反应，并在 532nm
3、处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 与 600nm 下的吸光度的差值计算MDA 的浓度。即：A 532A 600CL式中，A 532 和 A600 分别表示 532nm 和 600nm 处的吸光度值，C 是 MDA 浓度，L 为比色杯厚度，=155Lmmol -1cm-1。+10 COHNS NHOOHHHSHOO HOOHNHS2TBA MDA 3,5,5-三甲基恶唑 2,4-二酮需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对 MDA-TBA 反应有干扰作用。可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。 C（molL -1）=6.45(A 53
4、2A 600) 0.56A 450三、材料与设备1材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。2仪器：(1) 分光光度计； (2) 冷冻离心机；（ 3）水浴锅；(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml 刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3药品(1) 0.05mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液； (2) 5三氯乙酸溶液：称取 5g 三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到 100ml；(3) 0.5的 TBA 溶液：称取 0.5g 硫代巴比妥酸，用 5三氯乙酸溶解，定容至 100ml
5、。四、实验步骤1MDA 的提取：取样品 0.5g（W），加入 2ml 预冷的 0.05mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到 5ml 刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至 5ml。4500rpm，4 度，离心10min，上清液即为 MDA 提取液，测量提取液的体积（ V）。2MDA 含量测定：吸 2ml（V2）的提取液于刻度试管中（空白为 2ml 缓冲液），加入 3ml 0.5的 TBA 溶液，将试管放入沸水浴中煮沸 10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。4500rpm，4 度，离心
6、10min，取上清液并量其体积（ V1）。上清液于532nm、600nm 波长下测定吸光度。3结果计算:MDA(nmolg-1)6.452(A 532A 600) WV21式中，V 1 为反应液总量（ml） ；V 2 为反应液中的提取液数量(ml)；V 为提取液总量（ml） ； W 为植物样品重量(g) 。五、实验报告 样品 处理 重复 A532 A600 MDA 含量（ nmolg-1）1 2 高温处理 3 平均 标准差 1 2 3 平均 绿叶室温对照标准差 1 2 3 平均 高温处理标准差 1 2 3 平均 黄叶 室温对照标准差 六、思考题1TBA 为什么要溶解在三氯乙酸中？2提取液与 TBA 的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？3为什么要测定反应液在 600nm 下的吸光度？4如果可溶性糖含量影响 MDA 含量的测定，你有什么办法消除其影响？5正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。七、注意事项1可溶性糖与 TBA 显色反应的产物在 532 nm 也有吸收（最大吸收在 450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2低浓度的铁离子能增强 MDA 与 TBA 的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 0.5 nmol L-1）。3如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。
