1、抗生素研发与质量控制的热点问题,胡昌勤 中国药品生物制品检定所 ,药品监管,质量控制,质控分析,（目的）,（手段）,（方法）,药物质控分析、质量控制与药品监管的相互关系,药学,分析化学,（提供对象）,（理论和方法）,社会政治、经济发展的反映,社会发展的不同时期，各种政治、经济矛盾的焦点、热点不同，进而影响药品监管政策、法规的制定及药品的监管理念。 不同历史阶段的热点问题不同,国内抗生素研发的现状 现代分析技术对抗生素分析的影响 抗生素质控标准的发展趋势 目前国内抗生素研发的焦点,国内抗生素的研发现状,已仿制为主，几乎所有具有较好疗效的抗生素，国内均已仿制成功。仅有少数创新品种，如-内酰胺抗生素
2、，仅呋苄青霉素和头孢硫米是国内上市国外没有上市的。对少数创新品种的理化及生物学特性也未作深入的研究,近年来国内许多中小企业热衷于制剂的仿制，如进口分装，改剂型。 对原料药热衷于改进工艺，降低成本。 热衷于“独家”品种的研发。 热衷于抗生素复方制剂的研发。,问题：仿制品与原发产品一致吗？结构一致质量是否一致？制剂是否一致？疗效是否一致？,早期国内注射用头孢菌素的四大质量问题： 头孢唑林钠的澄清度 头孢哌酮钠的稳定性 头孢呋辛钠的颜色 头孢曲松钠的疗效,近年来较为突出的新质量问题： 注射用头孢曲松钠的澄清度 注射用头孢拉定的血尿 热不稳定抗生素输液的安全性,新药研发的薄弱环节1 忽视抗生素稳定性的
3、研究,晶型与稳定性的关系 水分与稳定性的关系 杂质与稳定性的关系,早期抗生素的四大质量问题,新药研发的薄弱环节2 对抗生素杂质的控制,工艺杂质 降解杂质,新药研发的薄弱环节3 忽视IPA与辅料、包材的相互作用,抗生素的新质量问题,新药研发的薄弱环节4 忽视制剂的质量,药品与包装测量的相容性,2005年的监督抽验中，发现多个企业的注射液用头孢曲松钠澄清度不合格，其原因是头孢曲松钠与丁基胶塞的相容性不好，胶塞中的残留物释放与药品相互作用形成不溶性复合物。,头孢曲松钠浊度与过敏反应当关系,对策 加强新药审批中的技术要求，促使企业在新药的研发阶段完成新药的基础研究； 利用单独定价等手段，鼓励企业开展研
4、究，提高已上市品种的质量。,现代分析技术对抗生素分析的影响,抗生素药品的特点,纯度一般较化学药品低 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发生变异 稳定性一般较化学药品差 结构较一般化学药品复杂,经典的抗生素质控分析方法,生物学分析方法在质量控制中占有重要地位 效价法测定含量 热原、降压物质、异常毒性控制纯度 仪器分析方法比重低，检测指标受主观因素影响大 澄清度、澄明度、溶液的颜色,与药品质量控制密切相关的分析仪器,各类色谱仪器的自动化程度越来越高 各类色谱仪器越来越专业化 凝胶色谱，离子色谱，逆流分溶色谱 色谱与光谱联用技术越来越成熟 HPLCUV， HPLCMS，HPLCNMR GCMS，GC
5、IR 各类数据库越来越丰富 联机智能化解析系统越来越普及,国外药典抗生素各论收载的新实验技术,NMR鉴别 （日抗基） 拉曼光谱（USP） 热分析（USP） HPLC电化学检测器（USP） 苯乙烯二乙烯基苯共聚物色谱柱 （EP、BP） USP26版开始，每版都有新类型的色谱柱增加，29版已增加至L62,与药品质量控制密切相关的分析技术,样品前处理技术 样品的富集、净化（固相萃取技术） 混和机理分析技术 柱切换技术、混和机理分离填料 色谱数据的标准化研究 色谱柱的分类、保留值的校准 色谱数据的解析,对抗生素分析的影响,多组分抗生素结构越来越清楚 含量与效价的关系越来越明朗 杂质的来源、结构越来越清
6、晰 质量和毒付反应的关系越来越明确,抗生素多组分抗生素,十六元环大环内酯类抗生素 吉他霉素 乙酰吉他霉素 麦迪霉素 麦白霉素 乙酰螺旋霉素 氨基糖苷类抗生素 庆大霉素 西索霉素 糖肽类抗生素,吉它霉素（Kitasamycin）,吉它霉素（Kitasamycin）组分分析,麦白霉素的色谱图,(a)醋酸铵系统 (b)三氟醋酸系统,麦白霉素的组分分析,乙酰吉它霉素及其水解产物,ACA，535：89-99, 2005,分析化学，34（1）：95-99，2006,药学学报，41（5）：475-480，2006,对抗生素分析的影响,多组分抗生素结构越来越清楚 含量与效价的关系越来越明朗 杂质的来源、结构越
7、来越清晰 质量和毒付反应当关系越来越明确,目前仍主要用效价表征活性的抗生素,大环内酯类抗生素 氨基糖苷类抗生素 糖肽类抗生素 多烯类抗生素 多肽类抗生素,效价单位,早期抗生素研发中，受分析条件的限制，无法确切测定抗生素的结构和组成，或无法得到其纯品，因此不能用重量单位来计量其活性，只能人为指定效价单位采用生物法来计量其活性。如青霉素单位也称牛津单位（Oxford unit），最初定义是“50ml肉汤培养基中，能抑制标准金葡菌生长的最少青霉素量为1个青霉素单位(u)”。在获得青霉素G纯品后，证明青霉素G钠（C16H17N2NaO4S）0.5988g1u。,纯品的效价测定结果,2007, 65,
8、203207,庆大霉素C组分纯品效价,每1mg庆大霉素C1a纯品相当于1189庆大霉素效价单位； 每1mg庆大霉素C2纯品相当于987庆大霉素效价单位； 每1mg庆大霉素C2a纯品相当于958庆大霉素效价单位； 每1mg庆大霉素C1纯品相当于968庆大霉素效价单位。,对抗生素分析的影响,多组分抗生素结构越来越清楚 含量与效价的关系越来越明朗 杂质的来源、结构越来越清晰 质量和毒付反应的关系越来越明确,头孢泊肟酯HPLC分析,头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图 1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A， 4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+3异构体，5=头孢泊肟酯异构
9、体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B,对抗生素分析的影响,多组分抗生素结构越来越清楚 含量与效价的关系越来越明朗 杂质的来源、结构越来越清晰 质量和毒付反应的关系越来越明确,细菌内毒素替代热原实验 异常毒性、降压物质实验基本取消 有关物质的控制 残留溶剂的控制 高聚物的控制 手性杂质的控制 残留蛋白、残留核酸的控制,抗生素质控标准的发展趋势,化学分析逐步取代生物学分析 有关物质的控制越来
10、越严格 多指标、多角度综合控制质量 指标、方法越来越细化,中国药典 杂质分析指导原则,按化学类别和特性，杂质可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。 按其来源，杂质可分为：有关物质（包括化学反应的前体、中间体、副产物、降解产物等）、其他杂质和外来物质等。,无机杂质 对采用了钯等催化剂的合成工艺，新药研发中应采用ICPMS测定其残留。有机挥发性杂质 残留溶剂 挥发性副产物 工艺杂质,新药研发中对合成工艺中用到的所有一类、二类溶剂及最后三步工艺中用的所有溶剂均需进行检测； 对残留溶剂分析中出现的其它色谱峰应进行归属。,对有关物质的控制,安全保障 工艺评价 工艺控制,含1%的杂质的产品一定比含2
11、%的杂质的产品好吗？安全性保证的条件： 杂质总类不变 杂质含量低,阿莫西林胶囊有关物质的比较,A企业 B企业,有关物质控制理念的变化,Purity control Impurity control Impurity Profiling Control,有关物质控制新理念 利用杂质谱控制生产工艺,例如头孢噻肟钠（Cefotaxime Sodium）是以发酵产品头孢菌素C为起始物，先经化学或酶催化反应生成7-氨基头孢烯酸（7-ACA），然后进行酰化反应生成头孢噻肟酸（CTAX），最后生成头孢噻肟钠（CTAX-Na）。由于起始物头孢菌素C含有DAO-CC、DA-CC和CC-LT等杂质，它们与头孢菌素
12、C结构相似，所以在半合成步骤中发生相同的反应，分别生成DAO-ACA、DA-ACA和ACA-LT，进而生成DAO-CTAX、DA-CTAX和CTAX-LT等杂质,头孢菌素C及其相关杂质结构,根据生产工艺确定控制对象,有关物质质控趋势, 各国药典的质控重点，以多样化的检测手段（UV/ECD/ELSD/RID）力求全面控制 EP/BP：品种多，信息全（杂质结构和色谱图） 中国药典2005年版新增订有关物质：90余个 USP：增修订重点,有关物质质控趋势, 梯度洗脱系统 系统适用性试验：利用多种手段制备降解溶液、单一成分或混合成分杂质对照品（Peak Identification CRS)等多种方式
13、相结合来定性。以分离度（R）为重点衡量指标。 定量：杂质对照外标法、加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法，归一化法等多种方式相结合来定量。,有关物质质控趋势,采用不同的检测方法控制相同的项目，但规定首选方法。如阿齐霉素有关物质的控制，USP30增补中固定UVHPLC方法为ECDHPLC方法的替代方法，但出现争执时以ECDHPLC方法为准。以解决方法的普及性问题。,YMC C18色谱柱分析利奈唑烷有关物质采用的梯度洗脱程序,梯度洗脱系统色谱柱与流动相的调整,tG为梯度间隔时间(min )；F为流速(ml/min )；V0为柱死体积；CB为梯度期间强溶剂B浓度的变化；S为与强溶剂和溶剂相关的
14、参数。,相同流速相同梯度变化率利奈唑胺系统适用性溶液色谱图,A，YMC常规色谱柱 B. Alltech常规色谱柱 C. Alltech高速色谱柱,A,B,C,选择同类型色谱柱 确定目标色谱峰，本实验利奈唑烷完全洗出后结束梯度1，运行梯度2 ； 梯度变化率（CB / tG）与流速均保持不变。本实验梯度1变化率为0.56%，梯度2变化率为3.67% ； 在FtG不变的前提下改变梯度间隔时间。,利用 网站上公布的色谱柱信息库,有关物质质控理念, 必须控制（设立检查项目） 全面检出（梯度，多方法互补） 有效分离（分离度） 目标明确（定性） 准确定量（外标或校正因子）,国内新药研发中对有关物质控制的误区
15、,重指标，轻方法 方法的有效性与样品的现状 对杂质的鉴别重视不够,重视分析方法的有效性评价（氨苄西林钠/舒巴坦钠）,原方法,新方法,杂质结构的确证方法 分析杂质来源 推测杂质的可能结构 采用LC/MS等技术验证可能结构 必要时采用反合成技术确证杂质,利用LC-MS快速筛查已知杂质,LC-MS质谱库的建立与应用,影响LCMS质谱库应用的因素,电离方式影响化合物的裂解 LC-MS的参数设置影响化合物的裂解 样品中化合物的量影响质谱图与谱库中标准谱图的配备程度,建立自己的标准谱库，是实现LCMS快速、准确筛选的关键。 我们目前已经建立了青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类抗生素、十六元大环内酯抗生素的LCM
16、S数据库。,关注安全性指标,高聚物的控制 无菌/微生物限度的控制,高分子杂质的分析方法,凝胶色谱系统,Sephadex G-10凝胶色谱系统,利用凝胶色谱的分子筛机制，让药物分子自由进入凝胶颗粒，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。 实验证明，Sephadex G-10凝胶（排阻分子量约700道尔吨）可基本保证所有-内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。,SephadexG-10凝胶色谱系统典型分离图,样品,对照,Kav=0,SephadexG-10凝胶色谱系统的弱点,对部分品种如碳青霉烯（美罗培南）等不宜分离 对部分品种分离不完全，抗干扰能力较弱； 部分品
17、种无法实现药物分子的缔和，实现准确定量； 分析时间较长； 色谱柱需经常重装； 对含敷料较多的口服制剂，特别是干混悬剂不宜使用 不知道杂质的组成,色谱峰分离不好,流动相对分离结果有影响,高效凝胶色谱系统,TSK高效凝胶色谱系统 Superdex pipted 高效凝胶色谱系统,Superdex peptide填料为葡聚糖交联琼脂糖凝胶； TSK 系列凝胶填料为亲水性多孔硅胶； 二者均富含羟基，能够与溶质的极性基团如氨基产生特异性相互作用，二者的特性相当。,高效凝胶色谱系统和 Sephadex G-10系统的比较,对阿莫西林原料的比较分析,1-5, 不同聚合度的阿莫西林聚合物 6, 阿莫西林开环二
18、聚体和阿莫西林闭环三聚体 7, 阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸 8, 阿莫西林主峰,阿莫西林在Superdex Peptide HR色谱系统中的典型色谱图,Sephadex G-10 Chromatographic System for Separation of HMW Impurities of Amoxicillin,Column: Sephadex G-10Mobile phase: 0.1mol/L phosphate buffer, pH 7.0 Flow rate: 0.9ml/min Detection: UV254nm,Comparative on different c
19、hromatographic column systems,高效凝胶色谱系统可以解决部分SephadexG10色谱系统所不能解决的问题 碳青霉烯中聚合物的分析 颗粒剂等口服制剂的分析 工艺考核,美罗培南在Sephadex G-10凝胶色谱系统中的色谱图,美洛培南聚合溶液的色谱图,Superdex Peptide PE7.5色谱柱 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0） 流速为0.4ml/min。 进样量为20l,开环二聚体（2号峰），闭环二聚体（3号峰），开环物（4号峰）,在pH9.0溶液中，开环物（5号峰）占的比例最大，开环二聚体（3号峰）和闭环二聚体（4号峰）比例相当； 在pH7.0
20、溶液中，美洛培南相对稳定，闭环二聚体占比例大； 在pH5.0溶液中，二聚体含量几乎与开环物相当； 在pH3.0溶液中，美洛培南几乎全部水解成开环物。,美洛培南在不同pH值环境下放置48h的色谱图,高效疏水凝胶色谱系统,TSK Gel G2500 HXL凝胶柱（填充剂为苯乙烯二乙烯基苯共聚物）3007.8mm i.d; 流动相:含0.26溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺溶液； 流速0.4ml/min; 检测波长为280nm。,高效凝胶色谱系统虽然较Sephadex G-10色谱系统有了较大的进步，但色谱峰之间不能完全分离仍然是普遍的问题。 解决方法： 采用反相色谱系统,HPLC反相色谱系统控制高分子
21、杂质,通过对指针性杂质的测定，表征药品中高分子杂质总量。,对阿莫西林及阿莫西林/克拉维酸钾 复方制剂的分析,阿莫西林杂质对照品典型色谱图1， 6氨基青霉烷酸 2，二酮哌嗪阿莫西林（2S） 3，二酮哌嗪阿莫西林（2R） 4，阿莫西林开环二聚体 5，阿莫西林闭环二聚体 6，阿莫西林闭环三聚体,阿莫西林聚合溶液在Superdex Peptide HR 色谱系统中的典型色谱图 1 阿莫西林高聚物 24不同聚合度的阿莫西林聚合物 5 阿莫西林开环二聚体和阿莫西林闭环三聚体 6 阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸 7 阿莫西林主峰,阿莫西林/克拉维酸钾高效凝胶色谱图1 高聚物 2 阿莫西林开环二聚体和闭环
22、三聚体 3重叠峰（包括阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸，克拉维酸） 4 阿莫西林主峰,阿莫西林克拉维酸钾(7:1)干混悬剂色谱图 A ,克拉维酸; B, 阿莫西林; C,辅料; 110有关物质（7为阿莫西林闭环二聚体）,阿莫西林克拉维酸钾颗粒剂（4：1）杂质的相关性,头孢泊肟酯HPLC分析,头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图 1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A， 4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头
23、孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B,如何在反相色谱系统中确定聚合物色谱峰,利用二维色谱技术实现凝胶色谱峰在反相色谱系统中的定位,高分辨率的智能化两维色谱,Analysis of phosphorylated peptides by IMAC-RP-LC,Separation of unretained fraction,Separation of retained fraction,IMAC unretained fraction,IMAC retained fraction,Valve is in position
24、 1,Valve is in position 2,1st Dimension IMAC,2nd Dimension on Acclaim 120,A,B,A,B,Sephadex G-10 凝胶色谱系统分析青霉素钠,Superdex piptide凝胶色谱系统分析青霉素钠,控制-内酰胺抗生素中的高分子杂质是安全性保障的需要 针对具体品种应采用不同的分析方法，而不应仅局限在Sephadex G10系统 伴随着科学技术的发展，通过对指针性杂质的控制，控制药品中高分子杂质的总量是未来质量控制的发展方向,无菌/微生物限度检查法,药品微生物分析,培养基质量,方法验证,建立方法时验证检验方法的有效性 日
25、常工作中验证实验系统的有效性 阳性对照,建立具有抗菌活性药物无菌/微生物限度检查法的一般流程,头孢菌素敏感菌的选择原则,第一代头孢菌素选择金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003，第三代头孢菌素选择大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(F) 44102，第二代和第四代头孢菌素选择金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌进行实验条件的筛选。,无菌实验,环境细菌的监测,药品的无菌检测,环境细菌与药品细菌的比较,结论,保证无菌检查结果有效性的途径,5株样品检出菌和近期环境菌库中相关细菌的相似性分析结果,热不稳定药品输液的无菌工艺保障,F0：指标准
26、灭菌条件（121）下的灭菌时间。 无菌保证需要 F08,L: 温度T的灭菌力与标准灭菌温度（121）灭菌力的关系系数,对热不稳定的抗生素能否在较低的温度下通过延长灭菌时间来实现无菌保障作用呢？ 121 8min 118 14min 105 30min,D121：121时微生物的致死时间；嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953孢子的D1211.7min,EP6.0,不同灭菌条件对嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953孢子悬液的灭菌效果比较,利用相关物质评价灭菌工艺的合理性,克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液与空白溶剂的典型色谱图1, 溶剂; 2, 林可霉素; 4, 5-羟甲基糠醛; 5, 合成杂质; 9, 克林霉素;3,6,7,8, 均为克林霉素磷酸酯酸降解物,不同加热时间点的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液色谱图 1：未加热 2：加热15 min 3：加热30 min 4：加热60 min,利用生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌）和相关物质检查同时评价热不稳定抗生素输液的灭菌工艺，是保障产品安全性的根本措施。,Thank You,
