1、(二) 无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养与数量测定,学习导航 1.学会无菌操作和接种技术。(重点) 2研究培养基对微生物的选择作用。(重点) 3了解平板分离微生物的方法和计数。(重点) 4简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。(难点),无菌,培养基,玻璃刮铲,穿刺,平板划线,2.无菌操作微生物接种技术的关键 (1)培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要_。 (2)通常接种操作要在_的附近进行。,灭菌,酒精灯火焰,1在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？ 提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。,想一想,二、微生物的分离 1.原理：根据微生物对_、氧
2、气、pH等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的_条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到_微生物的目的。 2.方法 (1)据菌落形态特征初步分离,营养成分,必需,选择分离,菌落：_微生物在适宜的_培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有一定_的子细胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，称为_。 菌落特征：不同微生物在_培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该类微生物进行_、_的重要依据。,单个,固体,形态结构,菌苔,特定,分类,鉴定,涂抹平板法,平板划线法,单个,(1)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。() (2
3、)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。() (3)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。() (4)稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。(),判一判,三、土壤微生物的分离和计数 1.准备实验器材 2.采集土壤，制备悬液 (1)制备悬液 称取0.5 g土壤样品，倒入盛有50 mL无菌水的锥形瓶，振荡20 min，使土样充分打散，即成为102 g/mL的土壤悬液。,(2)等比稀释 用无菌移液管吸取0.5 mL土壤悬液注入盛有4.5 mL_的1号试管，配成103 g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号试管3次，使悬液均匀，再吸取0.5 mL注入盛有4.5 mL
4、无菌水的2号试管，配成104 g/mL的土壤悬液。以此类推，依次配制成105 g/mL、106 g/mL、107 g/mL、108 g/mL的土壤悬液。,无菌水,3.选择适于分离特定微生物的培养基 不同微生物的代谢特性不同，通过 _可选出所需要的特定微生物。 4.接种 采用3支无菌移液管分别吸取108 g/mL、107 g/mL、106 g/mL的土壤悬液各1 mL加入培养皿中，每个浓度设置_个重复，并充分振荡混合均匀，用_平板法进行分离。,选择培养基,3,涂抹,5.培养与观察 将培养皿倒置于_ 恒温箱中培养1 2 d，观察细菌菌落。 6.计数菌落 培养2448 h后取出平板计数，选取菌落数为
5、30300的一组为代表进行统计。 每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(假定涂抹所用稀释液为1 mL)。,37,2A同学分离与培养土壤微生物时与其他同学的结果相差很大，请分析可能的原因是什 么？并进一步通过对照实验验证原因。,想一想,提示：,四、设计实验分离土壤中能分解纤维素的微生物 1.研究目的 从土壤微生物中筛选出能分解纤维素的微生物。 2.实验原理 纤维素分解菌可以分泌_，在用 _作为惟一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，其他微生物则不能生长。,纤维素酶,纤维素,3.方法步骤 (1)制备选择培养基：培养基中提供碳源的物质只有_。 (2)分装 (3)制备
6、土壤稀释液：依次制备稀释度为101、102、103、104、105的土壤稀释液。,纤维素,(4)接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液1 mL接种到滤纸条上，每个稀释度重复4次，置_中培养。 (5)观察：检查各试管中滤纸条上出现的_和滤纸颜色的变化情况。,培养箱,菌落,3在等比稀释的过程中如何使微生物在菌液中均匀分布？你认为计数的菌落与实际菌落之间存在什么样的关系？ 提示：每次吸取前都要将土壤悬液充分振荡混合均匀。实际菌落数目大于计数的菌落数目。,想一想,1.无菌技术的概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。,2.无菌技术的具体内容 (1)对实验操
7、作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 (3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 (4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。,特别提醒 在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。,细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( ) A接种环、手、培养基 B高压锅、手、接种环 C培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅,【解析】 此题考查学生对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于
8、培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。 【答案】 C,1.下列操作错误的是( ) A用酒精擦拭双手 B用氯气消毒水源 C实验室用紫外线进行消毒 D玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的,变式训练,解析：选D。玻璃器皿、金属用具等耐高温、需要保持干燥的物品，应采用干热灭菌法进行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的。,1原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落
9、。,2.常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。 3.方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生 长。 (2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。,(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。 4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的微生物的单个菌落。 (1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。 (2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行
10、，避免杂菌污染。 (3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。,(2012盐城高二检测)下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是 ( ) A操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭菌 B划线操作要在火焰上进行 C在5区域中才可以得到所需菌落 D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌,【解析】 操作前要将接种环放在酒精灯的外焰灼烧进行灭菌；整个操作过程要在酒精灯旁进行；1、2、3、4、5这五个区域都可能有所需菌落；在每次画线前对接种环灼烧是为了杀死上次画线结束后接种环上残留的菌种，画线结束后对接种环灭菌是为了杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境
11、和感染操作者。 【答案】 D,变式训练 2.有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是 ( ) A首先将菌液进行一系列的梯度稀释 B然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面 C适宜条件下培养 D结果都可在培养基表面形成单个的菌落,解析：选D。稀释涂抹平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,1.显微镜直接计数法 (1)原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。,(2)方法：用计数
12、板计数。计数板是特制的载玻 片，其上有特定的面积为1 mm2，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中 格，每个中格再被划分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。 (3)操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。,(4)计算公式 每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数。 (5)缺点：不能区分死菌与活菌。 2.间接计数法(活菌计数法) (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的
13、一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,(2)操作 设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落 数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培 养，计算出菌落平均数。,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。 3.滤膜法 (1)实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。,(2)过程：将已知体积的水过滤
14、后，将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。,特别提醒 统计菌落数目的注意事项： 一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。 设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是( ) A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板 B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上 C将实
15、验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时 D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,【思路点拨】 本题主要考查统计菌落数目的方法，解答本题需从以下几点入手： 区分实验材料的灭菌方法。 理解空白对照在菌落计数实验中的作用。 明确菌落计数的选择范围。,【解析】 本题考查的是土壤微生物总数的计数，所以培养所使用的培养基就应该是基本培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取104、105、106倍的土壤稀释液各0.1 mL进行涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，要同时把一培养基接种少量无菌水，以作空白对照；,培养一段时间后，如果平板上菌落
16、个数在30300之间，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均值，即可计算出土壤细菌的总数。而D项是菌落数在300以上，故D项错。 【答案】 D,互动探究 C项倒置平板的目的是什么？ 【提示】 防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成培养基污染。,【探规寻律】 每一稀释度下设置多于3个平板，一般选择菌落数在30300之间的平板计数。若几个平板的菌落数均不在30300之间，但几个平板菌落数目相近，且接近30300之间(如菌落数目为28、25、24、27)，则也可以取其平均值作为菌落数。,变式训练 3. (2012安康高二检测)自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，
17、然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。 步骤如下： 制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。,为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。 适宜温度下培养。 结果分析： (1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是( ) A一个平板，统计的菌落数是23,B两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24 C三个平板，统计的菌落数分别是21、5和 52，取平均值26 D四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25,(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上
18、菌落数的平均值为23.4，那么每升样品中的菌落数是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。 (3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_(多、少)，因为_。,解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂抹平板法接种样品。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强实验的说服力和准确性。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)23.40.21061.17108。(3)因为菌落可能由1个或多个大肠杆菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。,答案：步骤：稀释涂抹平板 (1)D (2)1.17108 (3)多 当两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上观察的
19、是一个菌落,【操作与实践】 微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。,微生物的分离,1.稀释 用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成101、102、103、104、105、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。,2.划线或涂布 (1)平板划线分离法在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种(如图)。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。,
20、特别提醒,平板划线法中的注意事项 取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：,从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,(2)涂布分离法取3个平板，底面分别用记号笔写上104、105和106三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510 min，使菌液吸附进培养基(如图)。,特别提醒 将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余
21、的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。 操作中一定要注意防火，不要将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。,3.培养 将划线或涂布接种的平板倒置于37 培养箱 中，培养1624 h，即可长出单菌落。,【问题与探究】 1.在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？ 【提示】 (1)酒精灯与培养皿的距离要适中。 (2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。 (3)接种环要用酒精灯灼烧。 (4)将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。,2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？ 【提示】 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要
22、重新制备。,3.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立菌落？ 【提示】 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。,【例题】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题： (1)培养基中加入的化合物A是_，为微生物的生长提供_，这种培养基从功能上进行分类，应属于_培养基。
23、,(2)若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答： 在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ _。 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ _。 除此之外，还可用_法来获得纯净的菌株。,【解析】 若筛选到能利用纤维素(可产生纤维素酶)的微生物，培养基中加入的化合物A，应为纤维素。制备只以纤维素作碳源的选择培养基，能在该培养基中生长的微生物应为可产生纤维素酶的微生物，此即目标微生物。 【答案】 (1)纤维素 碳源 选择,(2)第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落 划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造成污染 稀释涂抹平板,本部分内容讲解结束,按ESC键退出全屏播放,
