1、 本科学生实验报告学号： 124120463 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12 级生物技术班 实验课程名称： 酶工程实验一 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定一、目的要求1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。二、基本原理（一）淀粉酶产生菌的分离1.菌种的采集要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。2.富集培养原理：
2、采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。富集的方法：控制培养的温度、pH 和营养成分等。 3.菌种的分离淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与 3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在 540nm 进行测定。2.酶活定义：在一定 p
3、H5.5、 37条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1mol 葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位 U/g。酶活计算公式：酶活（U/g）=A5KN1000/（TW ）A:样品的 OD 值(平均值) K:标准曲线的斜率N:稀释倍数 5:0.2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T:反应时间（min） 1000:转换因子 1mmol=1000molW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3 绘制标准曲线先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度 A。以 A 为横坐标，浓度 c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步
4、骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量三、器材1 试剂:可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO412H2O 等2 培养基:分离、纯化培养基3 仪器:平皿、 三角瓶、大试管、 1mL 和 10mL 移液枪、涂棒；天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。四、操作步骤（一）淀粉酶产生菌的分离1.培养基的配制及灭菌倒平板配制分离培养基 高压灭菌 30min 冷却至约 50倒 7 块平板/140mL 冷却备用2.制备土壤稀释液称取土样 1g，放入 9mL 无菌水试管中，摇动 10min，
5、静置 10min,制备得到 10-1 土壤稀释液；用无菌吸管吸出 1mL 土壤悬液，加入盛有 9mL 无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到 10-2 土壤稀释液；再从中吸出 1mL 加入盛有 9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到 10-3 土壤稀释液；以此类推，分别制备得到 10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。3.涂布用无菌吸管分别吸取 10-3、10-4、10-5 、10-6 和 10-7 土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。4.培养纯化挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37倒置培养 23d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培
6、养)。5.产淀粉酶微生物的鉴定向平板内加入稀碘液数滴后进行观察（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.淀粉酶产生菌的发酵分离培养基（140mL）的配制：可溶性淀粉：0.7g 蛋白胨：0.7g 酵母膏：0.7gKH2PO4 : 0.07g MgSO47H2O :0.02g CaCl22H2O : 0.08g琼脂 : 2.8g配置发酵培养基 200mL/组（40mL/瓶） 将纯培养得到的（透明圈最大的） 菌落接种于发酵培养基中 30 150r/min 摇瓶发酵约 72h。2.葡萄糖标准曲线的制作 精确称取 0.100g 葡萄糖，用缓冲溶液定容至 100ml，制得浓度为 1mg/ml的葡萄糖
7、的标准溶液。标准曲线如下图表所示：葡萄糖标准溶液体积（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2葡萄糖含量（mg） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3定容总体积(ml) 15 15 15 15 15 15 15OD（540nm） 待测酶液的制备：a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件 4000 转/5 分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力b.底物溶液2%淀粉溶液（需当天配置）称取 2.0 克可溶性淀粉，用约 80mL 缓
8、冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，并用缓冲液定容至 100mL。注：如果测定所得 OD 值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。淀粉酶酶活测定方法操作步骤空白管 样品管 A 样品管 B步骤 1 吸取 1.8mL 可溶性底物溶液 吸取 1.8mL 可溶性底物溶液吸取 1.8mL 可溶性底物溶液步骤 2 37保温 5 分钟 37保温 5 分钟 37保温 5 分钟步骤 3 加入待测酶液 0.2 毫升加入待测酶液 0.2毫升步骤 4 37精确保温 15min 37精确保温 15min 37精确保温15min步骤 5 加入 3mLDNS 试剂终止反应 加入
9、3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止反应步骤 6 混合均匀 混合均匀 混合均匀步骤 7 加入 0.2 毫升待测酶液，沸水浴煮沸 5min沸水浴煮沸 5min 沸水浴煮沸 5min步骤 8 流水冷却 流水冷却 流水冷却步骤 9 加蒸馏水 10mL，混匀 加蒸馏水 10mL，混匀 加蒸馏水 10mL，混匀步骤 10 OD540nm 比色 OD540nm 比色 OD540nm 比色五、酶活测定注意事项注：1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；2.移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS 时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液
10、时可以不用更换枪头！3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5.实验结果的记录与分析六、实验报告（一）淀粉酶产生菌的分离结果筛选结果 稀释倍数产淀粉酶菌落数 菌落形态透明圈大小10-3 6菌落疏松，呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状，大多为白色，有的为淡黄色和黑色1.1cm,1.0cm0.9cm,0.8cm0.5cm,3cm10-4 1 绒毛状，圆形，白色 0.8cm10-5 1 絮状，白色 0.9cm10-6 1 絮状，淡黄色 0.5cm10-7 0 （二）葡萄糖标准曲线绘制葡萄糖标准曲线的制作编号 1 2 3 4 5 6葡萄糖含量
11、0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2OD（540nm） 0.084 0.285 0.491 0.718 0.922 1.133糖化酶活力测定结果葡 萄 糖 标 准 曲 线y = 0.9479x + 0.126R2 = 0.999800.20.40.60.811.21.40 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2OD葡萄糖含量（mg/ml）系 列 1线 性 (系 列 1)编号 样品管 A 样品管 BOD（540nm） 0.332 0.289糖化酶活力的计算OD 的平均值=（A+B）/2=(0.332+0.289)/2=0.3105根据酶活计算公式：酶活（U/g）=（(AK+b)N1
12、000/（TW） ）5A:样品的 OD 值(平均值) K:标准曲线的斜率N:稀释倍数 5:0.2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T:反应时间（min） 1000:转换因子 1mmol=1000molW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）代入数据可得：酶活（U/g）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(0.31050.9479+0.126）11000/(15180.2) 5= 0.77753、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。答：采集土样(除土层表面枯枝、 杂草和砂石， 收集距表层 5cm10cm 土壤)将采集的土样进行 10 -1 10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在 30的恒温箱中培养 3d，然后观察菌落周围是否形成透明水解圈。因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等 4种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。
