1、实验 5.2 刺激强度对肌肉收缩的影响 实验目的 学习神经 -肌肉实验的电刺激方法和记录肌肉收缩的方法。观察刺激强度与肌肉收缩之间的关系；掌握阈刺激、阈下刺激、阈上刺激、最大（最适）刺激等概念。实验原理 对于单根神经纤维或肌纤维来说，对刺激的反应具有“全或无”的特性。神经-肌肉标本是由许多兴奋性不同的神经纤维（细胞）-肌纤维（细胞）组成，在保持足够的刺激时间（脉冲波宽）不变时，刺激强度过小，不能引起任何反应；随着刺激强度增加到某一定值，可引起少数兴奋性较高的运动单位兴奋，引起少数肌纤维收缩，表现出较小的张力变化。该刺激强度为阈强度，具有阈强度的刺激叫阈刺激。此后随着刺激强度的继续增加，会有较多
2、的运动单位兴奋，肌肉收缩幅度、产生的张力也不断增加，此时的刺激均称为阈上刺激。但当刺激强度增大到某一临界值时，所有的运动单位都被兴奋，引起肌肉最大幅度的收缩，产生的张力也最大，此后再增加刺激强度，不会再引起反应的继续增加。可引起神经、肌肉最大反应的最小刺激强度为最适刺激强度，该刺激叫最大刺激或最适刺激。实验对象 蟾蜍或蛙实验药品 任氏液、仪器与器材 肌槽、张力换能器（50 100 g）、LMB-2B 二导生理纪录仪、刺激器或计算机生物信号采集处理系统；普通剪刀、手术剪、眼科镊（或尖头无齿镊）、金属探针（解剖针）、玻璃分针、蛙板（或玻璃板）、蛙钉、细线、培养皿、滴管、双凹夹。 实验方法与步骤 1
3、.坐骨神经腓肠肌标本的制备：方法有两种，其一制做成离体的坐骨神经 -腓肠肌标本，见实验 5.1（标本的制备）。其二制做成在体的坐骨神经-腓肠肌标本:（1）另取一只蟾蜍,洗净,按操作程序破坏脑和脊髓。（2）剥离一侧下肢自大腿根部起的全部皮肤，然后将蟾蜍腹位固定于蛙板上。（3）于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经游离，并在神经下穿线备用，然后分离腓肠肌的跟腱穿线结扎，连同结扎线将跟腱剪下，一直将腓肠肌分离到膝关节。（4）在膝关节旁钉蛙钉，以固定住膝关节。至此在体标本制备完毕。2. 仪器及标本的连结 ，有两种连结方式(图 5.2-1)：（1）对于离体标本：将肌槽、张力换能器均用双凹夹固定于支架上；
4、标本的股骨残端插入肌槽的小孔内并固定之；腓肠肌跟腱上的连线连于张力换能器的应变片上（暂不要将线拉紧）。夹住脊椎骨碎片将坐骨神经轻轻平搭在肌槽的刺激电极上。（2）对于在体标本：可将腓肠肌跟腱上的连线连于张力换能器的应变片上（暂不要将线拉紧）；将穿有线的坐骨神经轻轻提起,放在保护电极上,并保证神经与电极接触良好。调整换能器的高低，使肌肉处于自然拉长的状态（不宜过紧，但也不要太松）。然后可进行实验项目。若是使用二导生理记录仪进行记录，则将张力换能器的输出插头插入二导生理记录仪的 FD-2 的输入插孔；刺激器的输出导线与（肌槽的）电极相连。若是使用计算机生物信号采集处理系统进行实验，则将张力换能器的输
5、出插头插入该系统的一个信号输入通道插座（如 CH1）；电极的插头插入该系统的刺激输出插孔。打开计算机, 启动生物信号采集处理系统，进入“刺激强度对骨骼肌收缩的影响” 实验菜单。3. 使用单脉冲刺激方式,波宽调至并固定在 1 ms，刺激强度从零开始逐渐增大；首先找到能引起肌肉收缩的最小强度，该强度即是阈强度。描记速度要求每刺激一次神经，都应在记录纸或屏幕上记录（或显示）一次收缩曲线（应为一短线）。4. 将刺激强度逐渐增大，观察肌肉收缩幅度是否随着增加，记下的收缩曲线幅度是否也随之升高？5. 继续增大刺激强度，直至连续 34 个肌肉收缩曲线的幅度不再随刺激增高为止，读出刚刚引起最大收缩的刺激强度，
6、即为最适刺激强度。注意事项 1.刺激之后必须让标本休息一段时间，约 0.5 1 min。实验过程中标本的兴奋性会发生改变，因此还要抓紧时间进行实验。2.整个实验过程中要不断给标本滴加任氏液,防止标本干燥，保持其兴奋性。可能出现的问题与解释(1)未能找出最大刺激。虽已调至刺激器的最大刺激强度,但经液体介质短路后输出,强度有所降低,对刺激的神经仍不能达到最大刺激强度,此时可增大刺激波宽。(2)单收缩曲线忽高忽低。标本在任氏液中浸泡的时间不够,兴奋性不稳定；肌槽上液体堆积过多，造成短路使刺激强度不稳。(3)标本发生不规则收缩或痉挛。肌槽不干净,留有刺激物( 如盐渍)；周围环境有干扰；仪器接地不良或人
7、体感应带电，接触潮湿台面或支架等。实验结果 1.标记 “刺激强度与肌肉收缩张力之间的关系”曲线，剪辑、粘贴（或打印）。2. 骨骼肌收缩包括收缩和舒张两个时期，可测量的值有：峰值（最大值）、张力增量（发展张力）、收缩期和舒张 2/2 间期（图 5.2-3）。本实验要求统计全班各组的结果以平均值 标准差表示，并绘制不同刺激强度与腓肠肌收缩张力增量的关系曲线。思考题 1.引起组织兴奋的刺激必须具备那些条件？2.何为阈下刺激、阈刺激、阈上刺激和最适刺激？在阈刺激和最适刺激之间为什么肌肉的收缩随刺激强度增加而增加？3.实验过程中标本的阈值是否会改变？为什么？实验 5.3 刺激频率对肌肉收缩的影响 实验目
8、的 观察用不同频率的最适刺激刺激坐骨神经对腓肠肌收缩形式的影响及其特征。了解和掌握单收缩、复合收缩、强直收缩特征和形成的基本原理。实验原理 蛙的坐骨神经肌肉标本单收缩的总时程约为 0.11 s，其中潜伏期、缩短期共占 0,05 s，舒张期占 0.06 s(图 5.3-1)。若给予标本相继两个最适刺激，使两次刺激的间隔小于该肌肉收缩的总时程时，则会出现一连续的收缩，叫复合收缩（或收缩总和）。若两个刺激的时间间隔短于肌肉收缩总时程，而长于肌肉收缩的潜伏期和缩短期时程，使后一刺激落在前一刺激引起肌肉收缩的舒张期内，则出现一次收缩尚未完全舒张又引起一次收缩；若两次刺激的间隔短于肌肉收缩的缩短期，使后一
9、刺激落在前一次刺激引起收缩的缩短期内，则出现一次收缩正在进行接着又产生一次收缩，收缩的幅度高于单收缩的幅度（图 5.3-2）。根据这个原理，若给予标本一连串的最适刺激，则因刺激频率不同会得到一连串的单收缩、不完全强直收缩或完全强直收缩的复合收缩（图 5.3-3）。实验对象 蟾蜍或蛙实验药品 任氏液仪器与器材 见实验 7.2实验方法与步骤1. 坐骨神经腓肠肌标本的制备 见实验 5.1 或 5.2。2.仪器及标本的连结 见实验 5.2；当用计算机生物信号采集处理系统进行实验时，则打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“刺激频率对骨骼肌收缩的影响”模拟实验菜单。3. 以波宽为 1 ms,从最小刺
10、激强度开始逐渐增加刺激强度对肌肉进行刺激 , 找到刚刚引起肌肉最大收缩的刺激强度,即为该标本的最适刺激强度,整个实验过程中均固定在此刺激强度上（一般为 57.5 v）。4. 用单刺激作用于坐骨神经，可记录到肌肉的单收缩曲线。5. 用双刺激作用于坐骨神经，使两次刺激间隔时间为 0.060.08s,记录复合收缩曲线（纸速 2550 mm/s）。（3）将刺激方式置于 “连续 ”，其余参数固定不变，用频率为 1、6、 10、15、20、30 Hz 的连续刺激作用于作用于坐骨神经，可记录到单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩曲线(纸速 210 mm/s)。注意事项 1.经常给标本滴加任氏液，保持标本良好
11、的兴奋性。2. 连续刺激时，每次刺激持续时间要保持一致，不得超过 34 s（为什么？），每次刺激后要休息 30 s 以免标本疲劳。3.若刺激神经引起的肌肉收缩不稳定时，可直接刺激肌肉。4.可根据实际需要调整刺激频率。实验结果1.标记不同的收缩曲线，然后进行剪辑、粘贴（或打印）。统计全班各组的结果，以平均值标准差表示，绘制不同刺激频率与腓长肌收缩张力增量（最大时）的关系曲线。思考题1. 何为单收缩？单收缩的潜伏期包括了那些时间因素？对有神经和无神经的标本有何差异？2. 何为不完全强直收缩、完全强直收缩？它们是如何形成的？3. 肌肉收缩张力曲线融合时，神经干细胞的动作电位是否也发生融合？为什么？4
12、. 此次实验为什么要将刺激强度固定在最适刺激强度？5. 为什么刺激频率增高，肌肉收缩的幅度也增高？可能出现的问题与解释 (1)随着刺激频率增加 ,肌肉复合收缩的幅度不是逐渐升高 ,而是下降。标本保护不当,肌肉受损或疲劳,或刺激频率过高。(2)其余的参见实验 5.2。实验 6.2 血红蛋白的测定 实验目的 掌握用直接测定法和比色法测定动物的血红蛋白的含量。 实验原理 血红蛋白的颜色常与氧的结合量多少有关。但当用一定的氧化剂将其氧化时，可使其转变为稳定、棕色的高铁血红蛋白，而且颜色与血红蛋白（或高铁血红蛋白）的浓度成正比。可与标准色进行对比，求出血红蛋白的浓度，即每升血液中含血红蛋白克数（gL-1
13、）。 血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定的氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide,HiCN）。HiCN 在波长 540 nm 和液层厚度 1cm 的条件下具有一定毫摩尔消光系数。可用经校准的高精度分光光度计进行直接定量测定；或用 HiCN 标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。 实验对象 动物种类不限。 实验药品 HiCN 转化液（Van Kampen-Zijlstra 液，文齐氏液，标准商品）或 1%HCl、HiCN 标准液（200 gL -1，标准商品）、蒸镏水、95%酒精、乙醚、75%酒精.仪器与器械 血红蛋白计（或分
14、光光度计）或沙里氏血红蛋白计、小试管、刺血针或注射器，微量采血管，干棉球。 实验方法与步骤 1.使用血红蛋白计直接定量测定 （1）XK-2 血红蛋白仪板面结构如图 (6.2-1)：（2）仪器的标定 板面后的电源开关置于断。仪器的底部的支撑架打开。 打开电源开关，选择键处于测试挡。 按一下进样键，将蒸溜水吸入，预热 30 min 预热后将文齐试剂吸入，仔细调“调零旋钮”使显示屏上的数字显示为零。 校正：吸入标准液(仪器配带有)后，缓缓旋转校正旋钮使显示屏上数字显示为已知的标准液的数值。定标即结束。以后调零和校正旋钮均不能动。 （3）在小试管中事先加入 HiCN 转化液(文齐氏液)5 ml。 （4
15、）取血：可吸取从动物的指（尾）端流出的第二滴血，也可取静脉血和心脏血。用拇指和食指轻轻捏扁采血管的乳胶头，将采血管的一端水平接触血滴（若是抗凝血，须注意摇匀后再吸取），轻轻缓慢地松开拇指，利用虹吸现象使血液进入微量采血管至 20 l（第 2 个刻度）。用棉球擦去微量采血管尖端外周的血液。 （5）血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白：将微量采血管插入小试管 HiCN 转化液中，置血液于管底，再吸上清液 23 次，洗尽采血管内的残存的血液。用玻棒轻轻搅动管内血液，使之与 HiCN 转化液混匀。试管须静止 5 min。 (6)将混合后的血液吸入血红蛋白仪，显示屏上的数字即为测定值，需稳定后方可读数(gL
16、-1)。 2.使用 HiCN 标准液比色法测定 （1）标准曲线绘制和 K 值计算：将标准 HiCN 液按梯度 50 gL-1、100 gL -1、150 gL -1、200 gL -1进行稀释后（以此代表标准的血红蛋白浓度梯度），在波长 540 nm、光径 1.0cm 条件下，分别测定各稀释液的吸光度(例如分别测得 0.13、0.27、0.405、0.54)，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出换算常数 K。 （2）以上述同样的方法取血，并使血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。然后以转化液作空白，测定标本吸光度 A。 （3）通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用
17、K 值来计算血红蛋白浓度，即 Hb（gL -1）=KA (6.2-2) 3.使用沙里氏血红蛋白计测定 沙里氏比色法是用 HCl 使血红蛋白酸化形成棕色的高铁血红蛋白，然后和标准比色板进行比色。 （1）沙里血红蛋白计 主要具有标准褐色玻璃比色箱和 1 只方形刻度测定管组成。比色管两侧通常有两行刻度；一侧为血红蛋白量的绝对值，以 gdl-1(每 100 ml 血液中所含血红蛋白的克数)表示，从 222 g；另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从 10%160%。为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。 （2）具体测定方法如下： 用滴管加 56 滴，0.1
18、molL -1 HCl 到刻度管内,(约加到管下方刻度”2”或多或 10%处)。 用微量采血管吸血至 20 l(方法同上述)，仔细揩去吸管外的血液。 将吸血管中的血液轻轻吹到比色管的底部，再吸上清液洗吸管 3 次。操作时勿产生气泡,以免影响比色。用细玻棒轻轻搅动，使血液与盐酸充分混合，静置 10 min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。 把比色管插入标准比色箱两色柱中央的空格中。 使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，边滴，边观察、边对着自然光进行比色，直到溶液的颜色与标准比色板的颜色一致为止。 读出管内液体面所在
19、的克数，即是每 100 ml 血中所含的血红蛋白的克数。比色前，应将玻棒抽出来，其上面的液体应沥干净，读数应以溶液凹面最低处相一致的刻度为准。换算成每升血液中含血红蛋白克数（gL -1）。 注意事项 1.取血前要做好充分的消毒。 2.血液要准确吸取 20 l，若有气泡或血液被吸入采血管的乳胶头中都应将吸管洗涤干净，重新吸血。洗涤方法是：先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管 12 次，使采血管内干净、干燥。作为学生练习，微量采血管可反复使用。 3.使用血红蛋白仪测定时，吸样管应插入试管底部，避免吸入气泡，否则会影响测试结果。仪器连续使用时，每隔 4 小时要观察一次
20、零点，即吸入文齐试剂，用“调零旋钮”使仪器恢复到零点。仪器用完后，关机前要用清洗液清洗。否则会影响零点的调整。 实验结果 报告该实验动物的血红蛋白浓度。并将全班的结果加以统计,用平均值标准差表示。 思考题 血红蛋白的含量与年龄的关系？ 影响血红蛋白含量的主要因素？ 附： 1.HiCN 转化液：即文齐氏液，有标准商品出售。也可配制： 高铁氰化钾(K3Fe（CN）6)200 mg，氰化钾（KCN）50 mg，无水磷酸二氢钾（KH 2PO4）140 mg，Triton X-100 1.0 ml，蒸馏水加至 1000 ml。过滤后为淡黄色透明液体，pH 7.07.4，置有色瓶中加盖、冷暗处保存。如发现
21、试剂变绿、变浑浊则不能使用。 2.用分光光度计直接测定血红蛋白 （1）取血、血红蛋白转化和比色同前述 1、2 的方法，得到标本的吸光度 A。 （2）根据标本吸光度 A 直接计算出血红蛋白浓度： 式中 A：为波长 540nm 处标本吸光度。 44：为 HiCN 在波长 540nm，光径 1.0cm 条件下的毫摩尔消光系数（L mmol -1 cm-1）。 64485（mg）：为 Hb 的毫克分子量，即 1 mmolL-1 Hb 溶液中的 Hb 毫克数。 1000：为将 mg 转变为 g。 251：为血液稀释倍数。 因是通过分光光度计比色直接计算出血红蛋白浓度，因此分光光度计的波长和光程必须准确、
22、灵敏度要高、线性好、无杂光，否则会影响结果的准确性。故仪器的校正在测定中十分重要。 上述介绍的几种方法中，以分光光度计直接测定和比色法测定血红蛋白较为精确，但对分光光度计的精密程度要求较高，分光光度计校正起来较为麻烦。沙里氏血红蛋白计测定操作简便适于基层单位，但准确性稍差。血红蛋白计操作较为简便，因有标准的商品试剂出售，因此也比较精确，目前普遍被医疗单位使用。 实验 6.3 红细胞沉降率测定 实验目的 学习和掌握测定红细胞沉降的方法。 实验原理 红细胞在循环血液中具有悬浮稳定性,但在血沉管中,会因重力逐渐下沉。通常以第 1 小时末红细胞下降的距离,作为沉降率的指标，简称为血沉。血浆中的某些特性
23、能改变红细胞的沉降率,因此血沉可作为某些疾病检测的指标之一。 实验对象 动物种类不限。 实验药品 109 mmolL -1柠檬酸钠（柠檬酸钠（Na 3C6H5O72H2O）32 g，溶于 1000 ml 蒸馏水中），75%酒精。仪器与器材 血沉管（根据动物可采取的血量选择不同长度的血沉管），血沉架，试管，1 ml 移液管，刺血针，注射器及针头，带盖的小瓶，干棉球。 实验方法与步骤 1.取血：做好消毒，静脉取血 1.6 ml，加入含 109 mmolL-1 柠檬酸钠 0.4 ml 的抗凝管中，混匀。 2.吸血：将混匀的抗凝血吸入血沉管中至刻度“0”处，搽去血沉管尖端外周的血液并将血沉管直立于血沉
24、架上。 3.观察结果：1 h 末，准确读出红细胞下沉后暴露出的血浆段高度，即为红细胞沉降率。 注意事项 1.抗凝剂与血液比例为 1：4，并充分混匀。 2.血沉管放置要垂直，不得有气泡和漏血。 3.最好在 1825，并在采血后 2 h 内完成。 实验结果 报告该实验动物红细胞的沉降率。并将全班的结果加以统计,用平均值标准差表示。 思考1.决定红细胞沉降率的因素？2.在什么情况下，沉降率将升高 3.何谓红细胞悬浮稳定性？原理如何？ 实验 6.5 血细胞计数 实验目的 学习、掌握应用稀释法计数红细胞和白细胞的方法。 实验原理 血液中血细胞数很多，无法直接计数，需要将血液稀释到一定倍数，然后再用血细胞
25、计数板，在显微镜下计数一定容积的稀释血液中的红、白细胞数量，最后将之换算成每升血液中所含的红、白细胞数。 常用的血细胞计数板是改良式牛鲍尔计数板（Neubauer），为优质厚玻璃制成。每块计数板由“H”型凹槽分为两个同样的计数池(图 6.5-1)。计数池的两侧各有一个支持堤，比计数池高出0.1 mm。计数池的长、宽各 3.00 mm，平均分成边长为 1 mm 的 9个大格。每个大格容积为 0.1mm3。在 9 个大格中，位于四角的四个大方格是计数白细胞的区域，每个大方格又用单线分为 16 个中方格；位于中央的大方格用双线分成 25 个中方格，其中位于正中及四角的 5 个中方格是计数红细胞和血小
26、板的区域，每个中方格又用单线分为 16 个小方格(图 6.5-2)。实验对象 动物种类不限。 实验药品 蒸馏水，75%酒精，95%酒精，乙醚，1%氨水，血细胞稀释液： 哺乳动物红细胞稀释液：NaCl 0.5g， Na 2SO410H2O 2.5g，HgCl 0.25g，蒸馏水加至 100 ml。也可用生理盐水做稀释液 哺乳动物白细胞稀释液：冰醋酸 1.5 ml,1%结晶紫 1 ml 加蒸馏水至 100 ml。 鱼用血细胞稀释液：NaCl 0.7g（在遇到病鱼或红细胞脆性较大的鱼易出现溶血现象时，NaCl 可调整到0.70.8 g）, 中性红 3 mg,结晶紫 1.5 mg,甲醛 0.4 ml,
27、加蒸馏水至 100 ml。白细胞核被染成兰色，红细胞核呈非常淡的浅灰色或基本不染色，红细胞形态基本不变。在显微镜下容易区分。此液有效期较长。 仪器器材 显微镜，血细胞记数板（改良 Neubauer），小试管，微量（血红蛋白）采血管，1 ml、5 ml 移液管，玻璃棒，刺血针，干棉球。 实验方法和步骤 1.采血与血液的稀释： (1)加稀释液：用 5 ml 移液管取红细胞稀释液 2 ml 加入一小试管中，备用。用 1 ml 移液管取白细胞稀释液 0.19 ml 加入另一小试管中，备用。 (2)采血: 一般取动物的末梢血（或抗凝静脉血,方法见 3.6 有关部分）,采血前需进行消毒。 (3) 稀释:
28、用微量（血红蛋白）采血管吸两次 10l 血液，分别加至有红细胞稀释液和白细胞稀释液试管的底部，并用上清液清洗管内残留血液。分别摇动小试管，使稀释液与血液混匀。这样使红细胞稀释了 200 倍，白细胞稀释了 20 倍。 充池（布血） 将盖玻片的一边与计数池的纵线末端接触，然后缓慢放下，使盖玻片平放在计数室两侧的隆起上（这样可赶走盖玻片下的空气），用微量采血管或蘸有红细胞悬浮液的玻璃棒靠近盖玻片的前方边缘，靠毛细管作用将红细胞悬浮液充入计数池。室温中平放 35 分钟，待细胞下沉后显微镜下计数。若计数池未被布满或过多以致使盖玻片浮动，或弄到盖玻片外面都需重新充池（布血）。 计数： 于高倍镜下计数中间大
29、方格内四角及中央的 5 个中方格内红细胞总数。或四周四个大方格内的白细胞数。计数视野的移动路线如图 8.5-3 所示。如果细胞压边线，则按数上不数下，数左不数右原则进行。如果各中方格内的红细胞数相差 20 个以上(鱼类红细胞相对较少不应多于 10 个)，四周各大方格内的白细胞数相差 8个以上，则说明血细胞分布不均匀，需振荡稀释液，重新充池（布血）。 计算：（1）红细胞： 红细胞数L-1=N20010106255-1= N1010 N：表示 5 个中方格内数得的红细胞数； 255-1：将五个中方格红细胞数换算为一个大方格内红细胞数； 10：将一个大方格内红细胞数换算为 1l 血液内红细胞数。 1
30、06：1L=106l。 200：为血液稀释倍数。 (2).白细胞: 白细胞数L-1=N4-12010106= N5107 N：表示 4 个大方格内数得的白细胞数； N4-1: 换算成每个大方格内的白细胞数； 10：将一个大方格内白细胞数换算为 1l 血液内白细胞数。 106：1L=106l。 20：为血液稀释倍数。 （注：对于鱼类的白细胞计数，也可以采取与红细胞相同的方法进行。） 器械洗涤 （1）采血管： 作为学生练习，采血管可反复使用。当取血失败或计数完毕应立即按清水冲去血迹 蒸馏水 12 次 95%酒精 12 次 乙醚 12 次的顺序洗涤。如果采血管中有凝血块，则用 1%氨水浸泡，再按上述
31、顺序洗涤。 （2）血细胞计数板 血细胞计数板只能用清水浸泡、漂洗和蒸馏水漂洗，然后以丝绢轻轻拭净（或滤纸吸干）。 注意事项 取血操作应迅速,以免凝血。吸取血液时,采血管中不得有气泡,吸血和稀释液的体积一定要准确。 计数时，显微镜要放稳，载物台应置水平位，不得倾斜。一般在暗光下计数的效果较好。 实验结果 报告该实验动物的红细胞数和白细胞数。并对全班的结果加以统计，用平均值标准差表示。 思考题 1.稀释液装入计数板后，为什么要静止一段时间才开始计数？ 2.显微镜载物台为什么应置于水平位，而不能倾斜？ 3.分析影响计数准确性的可能因素。 实验 6.6 出血时间的测定 实验目的 学习出血时间的测定方法
32、。 实验原理 出血时间就是指小血管受到破损后血液流出至小血管封闭自行停止出血所需的时间，有时又称止血时间。止血的发生主要与小血管的收缩封住出血口、血小板粘附、聚集和释放血小板活性物质等一系列生理反应过程有关。观察出血时间是检测毛细血管功能和血小板数量及功能状态是否正常的简便而有效的方法。正常人出血时间约为 14 min 出血时间延长见于血小板数量减少或毛细血管功能缺损情况。 实验对象 小鼠 实验药品 乙醚 仪器器械 小烧杯，乙醚棉球，弯组织剪，洒精棉球，采血针，滤纸片，秒表。 实验方法与步骤 用手将小鼠固定，将小鼠头部伸入盛有乙醚棉花的小烧杯 13 min，使小鼠麻醉；用弯组织剪剪去小鼠腿部被
33、毛，并以酒精棉花消毒；用采血针刺入皮下，让血自动流出；立即记下时间，每隔30 S，用滤纸轻触血液，吸去流出的血，使滤纸上的血滴依次排列，直到无血流出为止，记下出血时间。并与人的出血时间加以比较。 注意事项 将小鼠麻醉时，小鼠可能会挣扎，此时不要松手；乙醚麻醉时间不要过长，以免造成小鼠死亡。采血时应让血自然流出，不要挤压。 实验结果 报告该实验动物出血时间。并对全班的结果加以统计，用平均值标准差表示。 思考题 1.论述正常生理性止血过程。 2.出血时间长短与何种因素有关？ 实验 6.7 凝血时间的测定 实验目的 学习凝血时间的测定方法。 实验原理 血液流出血管后，受到刺激的血小板就会释放出一系列
34、凝血因子，使血中的纤维蛋白原转化成网状的纤维蛋白，血液发生凝固。测定凝血时间可反映血液本身出凝血因子是否缺乏或减少。本实验用鱼作为实验材料比常规的家兔和鼠所用仪器要少，费用低，实验控制更易。 实验对象 150 g 重的鲤鱼。 仪器器械 注射器，玻片，尖针，秒表。 实验方法与步骤 1.取血方法： 将鱼用湿布包住，侧卧于木板上，在鱼尾部（腹鳍和尾鳍之间）侧线下方用手去除少许鳞片，将注射器在侧线下方 12 mm 处垂直插入肌肉，碰到脊椎骨后，稍往下方移动，插入尾静脉内，轻轻抽取注射器，让血在负压作用自然流入注射器内。 2.凝血时间观察： 将注射器内的血小心注在事先准血好的玻片上，记下时间，每隔 30
35、 s 用针尖挑血一次，直至挑起细纤维血丝为止。从开始出血到挑出细纤维血丝的时间即为凝血时间。 注意事项 湿布包鱼时仅将身体部位包住，不要包到鳃，以免影响鱼呼吸；如一时抽不出血可轻轻转动注射器，直至血被抽出为止；针尖挑血应向一个方向直挑，不可多个方向挑动或挑动次数过多，以免造成破坏纤维蛋白网状结构，造成不凝血的假象。 实验结果 报告该实验动物的凝血时间。并对全班的结果加以统计，用平均值标准差表示。讨论血液凝固对机体的生理意义。 思考题 论述测定出血时间和凝血时间的临床意义 出血时间长的患者凝血时间是否一定延长？ 实验 6.8 影响血液凝固的因素 实验目的 以血液凝固时间作为指标，了解对血液凝固影
36、响的因素，加深对生理止血过程的理解。 实验原理 血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血过程起动时激活因子来源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的激活过程。 实验对象 家免。 实验药品 25%氨基甲酸乙酯溶液，肝素（8 U/ml）、2%草酸钾溶液、生理盐水，液状石蜡、肺组织浸液（取兔肺剪碎，洗净血液，浸泡于 34 倍量的生理盐水中过夜，过滤收集的滤液即成肺组织浸液，存冰箱中备用）。 仪器器械 免手术台，常
37、规手术器械，动脉夹，动脉插管(或细塑料导管)，注射器，试管 8 支，小烧杯 2个，试管架,竹签 1 束(或细试管刷),秒表。 实验方法与步骤 1.静脉注射氨基甲酸乙酯溶液，按 5 ml/kg 的量，将兔麻醉，仰卧固定于兔手台上。正中切开颈部，分离一侧颈总动脉，远心端用线结扎阻断血流，近心端夹上动脉夹。在动脉当中斜向剪一小切口，插入动脉插管(或细塑料导管)，结扎导管以备取血。 2.试管准备好。 试管 1 不加任何处理（对照管） 试管 2 用液状石蜡润滑整个试管内表面 试管 3 放少许棉花 试管 4 置于有冰块的小烧杯中 试管 5 加肝素 8U 试管 6 加草酸钾 12 ml 试管 7 加肺组织浸
38、液 0.1 ml 3.放开动脉夹，每管加入血液 2 ml。将多余的血盛于小烧杯中，并不断用竹签搅动直至纤维蛋白形成。 4.记录凝血时间 每个试管加血 2 ml 后，即刻开始计时，每隔壁 15 s 倾斜一次，观察血液是否凝固，至血液成为凝胶状不再流动为止，记录所经历的时间。5、6、7 号试管加入血液后，用拇指盖住试管口将试管颠倒两次，使血液与药物混合。 5.如果加肝素和草酸钾的试管不出现血凝,可再向两管内分别加入 0.025 molL-1 的 CaCl 溶容液 23 滴,观察血液是否发生凝固? 注意事项 1.采血的过程尽量要快，以减少计时的误差。对比实验的采血时间要紧接着进行。 2.判断凝血的标
39、准要力求一致。一般以倾斜试管达 45o 时，试管内血液不见流动为准。 3.每支试管口径大小及采血量要相对一致，不可相差太大。 实验结果 将实验结果及各种条件下的凝血时间按表 8.8 填写,并进行比较、分析解释产生差异的原因。思考题 1.血液凝固的机制及影响血凝的外界因素？ 2.为什么有几管不凝？为什么有几管比对照组管凝血时间长？为什么有几管比对照管凝血时间短？实验 7.1 蛙心起搏点观察 实验目的 用结扎法观察两栖类动物心脏的起搏点和心脏不同部位传导系统的自动节律性高低。 实验原理 心脏的特殊传导系统具有自动节律性，但各部分的自动节律性高低不同。两栖类动物的心脏起搏点是静脉窦(哺乳动物的是窦房
40、结)。正常情况下，静脉窦（窦房结）的自律性最高，能自动产生节律性兴奋，并依次传到心房、房室交界区、心室，引起整个心脏兴奋和收缩，因此静脉窦（窦房结）是主导整个心脏兴奋和搏动的正常部位，被称为正常起搏点；其他部位的自律组织仅起着兴奋传导作用，故称之为潜在起搏点。 实验对象蛙或蟾蜍实验药品任氏液仪器器械蛙板蛙类常用手术器械一套，蛙钉，玻璃分针，秒表，滴管。实验方法与步骤 1.实验的准备 （1）在体蛙心的制备 见实验 5.4 2. 实验项目 (1) 观察蛙心各部分收缩的顺序 重温蛙心脏的结构,从心脏背面观察静脉窦，心房和心室的跳动，记录每分钟的收缩次数(次min-1)，注意它们的跳动次序 (2) 斯
41、氏第一结扎 分离主动脉两分支的基部，用眼科镊在主动脉干下引一细线。将蛙心心尖翻向头端，暴露心脏背面,在静脉窦和心房交界处的半月形白线（即窦房沟）处将预先穿入的线作一结扎(即斯氏第一结扎,图 7.1-1)以阻断静脉窦和心房之间的传导。观察蛙心各部分的搏动节律有何变化，并记录各自的跳动频率(次min-1)。待心房、心室复跳后，再分别记录心房心室的复跳时间和蛙心各部分的搏动频率 (次min-1) ，比较结扎前后有何变化？(3) 斯氏第二结扎 第一结扎实验项目完成后，再在心房与心室之间即房室沟用线作第二结扎(即斯氏第二结扎,图 7.1-1)。结扎后，心室停止跳动，而静脉窦和心房继续跳动，记录其各自的跳
42、动频率(次min-1)。经过较长时间的间歇后，心室又开始跳动，记录心室复跳时间，及蛙心各部分的跳动频率(次/min-1)。 注意事项 1.结扎前要认真识别心脏的结构。 2.结扎部位要准确地落在相邻部位的交界处，结扎时用力逐渐增加，直到心房或心室搏动停止。 3.斯氏第一结扎后，若心室长时间不恢复跳动，施实斯氏第二结扎则可能使心室恢复跳动。 实验结果 记录并分析各项结果。 思考题 1.正常情况下，两栖类动物（或哺乳类动物）的心脏起搏点是心脏的哪一部分？它为什么能控制潜在起搏点的活动？ 2.斯氏第一结扎后，房室搏动发生什么变化，为什么? 3.斯氏第二结扎后，房室搏动情况又有何不同，为什么? 4.如何
43、证明两栖类心脏的起搏点是静脉窦? 实验 7.5 微循环观察 实验目的 学习用显微镜或图像分析系统观察蛙肠系膜微循环内各血管及血流状况，了解微循环各组成部分的结构和血流特点。观察某些药物对微循环的影响。 实验原理 微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环，是血液和组织液进行物质交换的重要场所。经典的微循环包括微动脉、后微动脉、毛细血管前括约肌、真毛细血管网、通血毛细血管、动-静吻合支和微静脉等部分。 由于蛙类的肠系膜组织很薄，易于透光，可以在显微镜下或利用图像分析系统直接观察其微循环血流状态、微血管的舒缩活动及不同因素对微循环的影响。 在显微镜下,小动脉、微动脉管壁厚，管腔内径小，血流速度快，血流
44、方向是从主干流向分支，有轴流（血细胞在血管中央流动）现象；小静脉、微静脉管壁薄，管腔内径大，血流速度慢，无轴流现象，血流方向是从分支向主干汇合；而毛细血管管径最细，仅允许单个细胞依次通过。 实验对象 蛙或蟾蜍。 实验药品 任氏液，20%氨基甲酸乙酯溶液，1:10000（g/ml）去甲肾上腺素，1:10000（g/ml）组胺。 仪器与器械 显微镜或计算机微循环血流（图像）分析系统，有孔蛙板，蛙类手术器械，蛙钉，吸管，注射器（12 ml）。 实验方法与步骤 1.实验准备：取蛙或蟾蜍一只，称重。在尾骨两侧进行皮下淋巴囊注射 20%氨基甲酸乙酯（3 mg g-1），约 1015 min 进入麻醉状态。
45、用大头针将蛙腹位（或背位）固定在蛙板上，在腹部侧方做一纵行切口，轻轻拉出一段小肠袢，将肠系膜展开，小心铺在有孔蛙板上，用数枚大头针将其固定（图 7.5-1）。图 7.5-1 蛙肠系膜标本固定方法 2实验项目： （1）在低倍显微镜下，识别动脉、静脉、小动脉、小静脉和毛细血管(图 7.5-2)，观察血管壁、血管口径、血细胞形态、血流方向和流速等有何特征？图像经摄像头进入计算机微循环血流(图像)分析系统,对微循环血流做进一步分析. 图 7.5-2 蛙肠系膜微循环的观察 （2）用小镊子给予肠系膜轻微机械刺激，观察此时血管口径及血流有何变化？ （3）用一小片滤纸将肠系膜上的任氏液小心吸干，然后滴 加几滴
46、1:10000（g/ml）去甲肾上腺素于肠系膜上，观察血管口径和血流有何变化？出现变化后立即用任氏液冲洗。 （4）血流恢复正常后，滴加几滴 1:10000（g/ml）组胺于肠系膜上，观察血管口径及血流变化。 注意事项 （1）手术操作要仔细，避免出血造成视野模糊。 （2）固定肠系膜不能拉的过紧，不能扭曲，以免影响血管内血液流动。 （3）实验中要经常滴加少许任氏液，防止标本干燥。 实验结果 根据实验的观察,对微循环血流情况加以描述，并加以分析。 思考题 1.低倍镜下如何区分小动脉、小静脉和毛细血管？各血管中血流有何特点？如何与生理机能相适应？2.试解释不同药物引起血流变化的机制。 实验 8.4 呼
47、吸运动、胸内负压及膈神经放电的同步观察 实验目的 学习呼吸运动的描记方法；验证胸内负压的存在；学习膈神经放电记录的方法。观察、理解三者之间的相互关系，以加深对呼吸运动的产生及调节的理解。 实验原理 节律性呼吸运动是由于呼吸中枢产生的节律性冲动,通过脊髓发出的膈神经及肋间神经传出，引起膈肌和肋间肌节律性收缩,而产生胸廓有规律地扩张与缩小引起。呼吸运动除可直接观察外,还可通过膈神经放电观察。 呼吸过程中肺能随胸廓的扩张而扩张，是因为在肺和胸廓之间有一密闭的胸膜腔，其内的压力低于大气压，故称为胸膜腔内负压。胸膜腔内负压是由肺的弹性回缩力所产生，其大小随呼吸深度而变化。破坏胸膜腔的密闭性，胸腔内负压消
48、失，造成肺不扩张，引起呼吸困难，肺的牵张感受器向呼吸中枢发放的冲动减少，膈神经放电活动也将减少。 实验对象家兔。 实验药品 20%氨基甲酸乙酯溶液、0.9% NaCl 溶液、0.01%乙酰胆碱溶液、液体石蜡、CO 2气体等。 仪器与器械 生物信号采集处理系统（或二道生理记录仪、前置放大器、示波器、水检压计、监听器）、压力换能器、张力换能器、引导电极、兔用手术器械一套、兔固定台、气管插管、胸内套管（或带橡皮管的粗穿刺针头）、20 ml 注射器一个、微量注射器、50 cm 长橡皮管、玻璃分针、橡皮膏、纱布、棉线。 实验方法与步骤 1.麻醉和固定动物及气管插管： 方法同实验 8.2 2.呼吸运动的描记 方法同实验 8.2 3、分离膈神经，记录膈神经放电 用止血钳在颈外静脉(在外侧皮下)和胸锁乳突肌之间向深处分离，直到气管边上，可看到较粗的臂丛神经向后外行走。于臂丛的内侧有一条较细的膈神经横过臂丛神经并和它交叉，由颈部前上方斜向胸部后下方，用玻璃分针仔细分离之，并除去神经上附着的结缔组织，于其下穿线备用（图 8.4-1）。将膈神经钩在悬空的引导电极上，避免触及周围组织、颈部皮肤接地，以减少干扰。在手术过程中应随时以温热生理盐水润湿神经。整个实验过程中，神经 上覆盖浸有液体石蜡的棉条，以
