1、细胞化学染色实验,一、过氧化物酶(Peroxidase Stain，POX)染色,【目的和原理】细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生态氧。后者将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，进而形成棕色化合物沉淀于酶的所在部位。,【器材和试剂】 1第一液联苯胺 03g360gL亚硝基铁氰化钠饱和液 lml95L醇 加至 lOOml贮存于棕色瓶中，可保存一年。小瓶分装备用。2第二液 (稀过氧化氢液，新鲜配制)3过氧化氢 03ml蒸馏水 25ml,【步骤和方法】 1于新鲜干燥血涂片或骨髓涂片上，滴加第一液5-8滴，使盖满整个血膜，作用1-2min. 2滴加等量的第二液，混匀
2、，染4-8min。 3勿倾去染液，直接用水冲洗。 4干燥后再用瑞氏染液复染。,【结果】 在细胞的胞浆中出现蓝色或蓝棕色颗粒为阳性反应。1阳性反应强度的判断：阴性：无颗粒。弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳性：颗粒略粗，分布较密集。强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。,2粒细胞系统：早期原始粒细胞阴性，晚期(分化好)原始粒细胞以下各阶段呈阳性，粒细胞越成熟POX反应越强。但衰老的中性粒细胞酶活性降低，反应程度减弱，甚至呈阴性反应。嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色，嗜碱性粒细胞阴性。,3单核细胞系统：除早期原始阶段外皆呈弱阳性反应。其颗粒细小，弥散分布，可覆盖核上，有的也可呈阴性反应。 4正常网状细胞
3、(分化型)及吞噬细胞：可呈不同程度阳性反应。 5淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞系统等：均为阴性。 6Auer小体：呈阳性。,【临床意义】 POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(简称急粒)、急性单核细胞白血病(简称急单)、急性淋巴细胞白血病(简称急淋)类型的重要细胞化学方法。,1急性粒细胞白血病：细胞分化较好时，原始粒细胞呈阳性反应，阳性率可30%，在分化较差的白血病，如AML-M0和未分化型（AML-M1）的部分病例，原粒细胞的POX染色也可呈阴性。 2急性早幼粒细胞白血病时白血病细胞呈强阳性反应。,3急性淋巴细胞呈阴性反应，FAB分型规定POX阳性率20%，但难于区分原粒和原单时可进一步作酯
4、酶染色鉴别。,5、急性单核细胞白血病：原单和幼单POX多呈弱阳性或阴性，单核细胞呈弱阳性，阳性率常3%，阳性颗粒较为细小、稀疏。,6、中性粒细胞髓过氧化酶缺陷症：中性粒细胞POX染色，纯合子呈阴性，杂合子多为弱阳性。在一些髓系细胞白血病，如部分慢性髓细胞白血病（CML）患者，中性粒细胞POX染色可呈阴性或弱阳性，提示POX获得性缺陷。,【注意事项】 1过氧化氢必须新鲜配制。过氧化氢的最适浓度是005molL左右，浓度过高，反而抑制酶作用。一般采用5ml蒸馏水，加3过氧化氢一滴。若用30的过氧化氢时，只能在100ml蒸馏水中加12滴。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示过氧化氢过
5、浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。,2.染色时稀释过氧化氢之后必须与联苯胺液充分混合，否则同一涂片细胞染色情况不一致。,【评价】POX染色是鉴别急性白血病类型最常用的细胞化学染色方法。但若原始细胞均呈阴性（阳性率3），并不能肯定是急性淋巴细胞白血病，因为分化较差的白血病性原粒细胞、原单细胞、原巨核细胞、原淋巴细胞均可呈阴性，此时应结合其他细胞化学染色、细胞免疫表型分析等进行鉴别。,二、铁 染 色(Iron Stain),【目的和原理】 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也
6、可用此法显示。,【材料】 1.酸性亚铁氰化钾溶液取200gL亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200gL亚铁氰化钾溶液，亦边滴边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。 22gL核固红-硫酸铝溶液 取硫酸铝2g溶于100ml蒸馏水中，再加入核固红 (Emerk出品)0.2g。置37水浴中1h并随时振荡，使溶解，过滤后使用。,【步骤和方法】1.选骨髓小粒丰富的骨髓片，用甲醇固定10min，待干。2玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，染色30min(可置37环境)3. 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染1015min。4流水冲洗、待干、镜检。,【结果】(1)幼红细胞核呈鲜红色，
7、浆呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。(2)细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。,(-)：无颗粒(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠)。(+)：有较多的铁颗粒和小珠。(+)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(+)：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。,(3)细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。并根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：I 型：幼红细胞内含铁粒1-2粒；型：幼红细胞内含铁粒3-5粒；型：幼红
8、细胞内含铁粒610粒；型：幼红细胞内含铁粒10粒。,(4)环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6粒以上，其中23以上的铁粒围核成完全或不完全性环形(围核12以上的区域有铁粒环绕)。,【临床意义】1参考值 细胞外铁+-+(23人为“+”，13人为“+”)。细胞内铁阳性率为19-44，平均214，以I型为主，少数为型，所见铁粒较细而浅染，散在分布，一般位于胞浆的外侧，及型以及环形铁粒幼红细胞少见。,2鉴别缺铁性贫血及某些溶血性贫血。缺铁性贫血骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞阳性率0-28，平均34，所见铁粒极细少而着色浅，以I型为主， 型者极少见， 型以上者不见。,3用于诊断铁粒幼红细胞性贫血 这时能找到数量不等的环型铁粒幼红细胞，并多见粗颗粒的型与型铁粒幼红细胞。,【注意事项】1玻璃片需经无铁处理 将新片经清洁液浸泡24h，取出反复水洗后浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5盐酸中24h，用双重蒸馏水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。 2酸性亚铁氰化钾液须新鲜配制。3水洗时勿在水流下猛冲，以免髓粒脱落。,
