1、薄层色谱法 在中药质量分析中的应用,彭维,一、中药质量控制常用的分析方法,容量分析 定性：颜色反应沉淀反应气体生成气味变化定量：四大滴定法 光谱法 定性：UV、IR定量：UV、Flu（计算分析） 色谱法 定性：定量：,常用的色谱分析方法,薄层色谱法（TLC） 柱色谱 高效液相色谱法（HPLC） 气相色谱法（GC） 离子色谱 高效毛细管电泳色谱（HPCE） 高速逆流色谱（HSCCC）,常用的薄层色谱法,纸色谱 正相色谱反相色谱 薄板色谱 分配薄层色谱吸附薄层色谱离子交换薄层色谱凝胶薄层色谱 薄膜色谱 聚酰胺 薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,二、薄层色谱的基本参数,比移值：Rf= 原点中心至斑点中心
2、的距离原点中心至溶剂前沿的距离Rf=0 斑点仍在原点Rf=1 斑点已到前沿相对比移值R(I.S)=Rf(I)/Rf(S),Rf在10之间,前沿,原点,二、薄层色谱的基本参数,分配系数（K） K=CL/CM 容量因子（k=(1-Rf) Rf） k=0的组分Rf1，表示该组分不被固定相保留 k=的组分Rf0，表示该组分不被流动相带走,完全被固定相保留在吸附或分配色谱中，在选定固定相后，就是要通过改变流动相的极性，改变容量因子，达到改变被分离物的Rf目的,二、薄层色谱的基本参数,理论塔板数（n） 在选定了固定相、展开剂后，理论塔板数取决于吸附剂的粒度、均匀度、活度、及展开剂的流速、展开温度、湿度、展
3、开方式 n16（D / W）2 D为原点到前沿的距离；W为组分斑点宽度,二、薄层色谱的基本参数,分离度（R）R d (W1+W2)/2 d为相邻两斑点间的距离 W1和W2分别为相邻两斑点的宽度 R1.5时，两斑点达到基线分离,三、TLC常用仪器,自动铺板器,三、TLC常用仪器,三、TLC常用仪器,自动点样器,三、TLC常用仪器,全自动多级展开仪,三、TLC常用仪器,自动喷雾器 自动加热器,三、TLC常用仪器,TLC仪器,四、薄层色谱的基本流程,制备固定相,样品溶液的制备,色谱前衍生化,薄层板活化,展开,展开,定位,显色,滤纸或薄层板预平衡,定性,定量,点样,滤纸或薄层板预处理,（一）TLC薄层
4、板制备：,将1份固定相和3份0.31.0%Na-CMC溶液（水、NaOH溶液）在研钵中向一方向研磨混合，去除表面及内部的气泡后， 倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm）， 取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110烘30分钟。 即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。,（二）供试品溶液的制备,超声振荡法：采用溶剂超声提取出样品中待测成分，舍弃其他成分。 加热回流法：采用溶剂回流提取出样品中待测成分，舍弃其他成分。 溶剂萃取法：采用溶剂萃取出样品中待测成分，舍弃其他成分。 注意：定性和定量的差别。,（三）点样：
5、,除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.02.0cm，点样直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。 点样时必须注意勿损伤薄层表面。,（三）点样：,使用的材料点样器材定量点样毛细管（美国）微量注射器（针尖平头）自动点样器,（四）展开：,展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至
6、规定距离（一般为1015cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。,（五）显色,自然光 UV（254、366nm） 荧光 碘熏、氨熏 喷显色剂（晾干或加热后） 多次显色,（五）专属性显色剂,黄酮类：AlCl3试液 香豆素类：氨熏、NaOH试液 内酯类：硫酸乙醇液 酚类：FeCl3试液,五、TLC的固定相,常用固定相或载体：硅胶G、硅胶CMC硅胶GF254 、硅胶GF366硅胶H、硅胶R、硅胶P硅胶HF254、硅胶（60、40）硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。,TLC常用固定相,手工自制板：玻璃：12mm优质平板玻璃光洁、平整洗净至不挂水珠，晾干预制
7、板：普通薄层板和高效薄层板 商品硅胶G（石膏作粘合剂） 硅胶GF254（荧光剂）粘合剂：羧甲基纤维素钠水溶液（0.20.5）,（一）TLC 常用固定相的选择与应用,固定相 分离机制 主要应用范围氧化铝 吸附色谱 生物碱、甾体、萜类、脂肪、芳香化合物 硅胶 未改性硅胶 吸附色谱 硅胶60 三萜皂苷、香豆素、挥发油 高纯硅胶60 改性硅胶 生物碱 C2、C8、 C18、RP板 正相及反相 CHIR（手性） 配体交换色谱 对映体的分离 NH2板 正相 核酸、农药、酚类、嘌呤及衍生物、甾类、维生素类、磺酸类、羧酸类、磺嘌呤类等 CN板 正相及反相 农药、酚类、防腐剂、甾类 DIOL板 弱阴离子交换色谱
8、 色谱 甾类、激素类,（一）TLC 常用固定相的选择与应用,固定相 分离机制 主要应用范围纤维素未改性纤维素 分配色谱 氨基酸、羧酸及碳水化合物乙酰化纤维素 正相、反相 蒽醌类、抗氧剂、多环芳香、硝基化物离子交换纤维素 阴离子交换 氨基酸、肽、酶、核酸、核苷类DEAE纤维素 离子交换 核酸水解产物、单及多核苷酸硅藻土 处理后作反相 黄曲霉素、除草剂、四环素聚酰胺 分配色谱 黄酮类、酚类葡聚糖凝胶 分子筛 蛋白质、核苷酸、多糖等 其他磷酸氢钙 吸附色谱 类胡萝卜素、维生素E三聚硅酸镁 吸附色谱 类胡萝卜素、维生素E氢氧化钙 吸附色谱 类胡萝卜素、维生素E 硫酸钙 吸附色谱 脂肪酸、甘油酯氢氧化铁
9、 吸附色谱 极性化合物活性炭 吸附色谱 非极性化合物,TLC用硅胶的技术数据,薄层用硅胶的技术数据 参数 范围 典型值 密度/（g/cm2） 0.3-0.5 0.4 比表面积/(m2/g) 400-600 500 孔经/nm 2-15 6 pH 5-7 7.0 粒度/m 10-50 40,TLC用硅胶的技术数据,硅胶、氧化铝活度与吸附性的关系 活度级别 含水量 吸附力硅胶 氧化铝 10 3 12 6 15 10 20 15,增强,TLC中的流动相,一、溶剂的分类 第类为电子受体溶剂：甲苯、苯、氯苯、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙腈。 第类为质子给予体溶剂：异丙醇、正丁醇、无水乙醇、甲醇。 第类为
10、强质子给予体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲醇及水。 第类为质子受体溶剂：三乙胺、乙醚 第类为偶极作用的溶剂：1,2二氯乙烷、二氯甲烷 第类为惰性溶剂：环己烷、正乙烷、四氯化碳,TLC中的流动相,二、溶剂强度 溶剂强度是指单一或混合溶剂洗脱某种溶质的能力 正相色谱中：流动相溶剂强度增大，洗脱力增强 反相色谱中：流动相溶剂强度增大，洗脱力减弱,定性方法举例,【鉴别】取本品10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮对照药材1g，加60乙醇适量，置水浴上面回流半小时，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。再取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对
11、照品溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述三种溶液各2l，分别点于同一用0.5氢氧化钠溶液制备的硅胶G板上，以醋酸乙酯甲醇水（100：17：13）为展开剂，展距约3cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。,灵敏度试验及点样顺序,1 2 3 4 5 6 7 8 9,1 2 3 4 5 6,定量方法举例,点样顺序及要求,光谱扫描选择测定波长及参比波长,纯度检测的方法之一,有关物质,取本品，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含1mg的溶液，作为供试品溶液；另取本品，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中华人民共和国药典2005年一部附录 B）试验，精密吸取供试品溶液10l、对照溶液2l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-乙酸乙酯-水-冰醋酸（20:40:4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，60加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品溶液如显有杂质斑点，其荧光强度与对照品溶液比较，不得更强。,谢谢,
