1、 销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences维真慢病毒系统产品手册声明:1、Vigene 生物科技公司的产品仅限用于研究,不可用于包括人类或体外诊断和治疗在内的其他用途。2、Vigene 生物科技公司的产品,不得修改和转售、转赠给任何第三方,未经 Vigene 生物科学公司的书面批准,不得将产品用于向其他第三方提供服务或用于制造商品化产品。产品有限责任担保Vigene 生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了 Vigene 更换产品的责任。V
2、igene 生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene 生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。产品储存收到产品后,请第一时间在 BL2 生物安全柜中根据实验所需量将病毒进行分装。分装病毒时请将病毒始终放置在冰上。分装的病毒可在 4 保存 3 天,其余病毒请于 -80 冰箱冻存。请避免反复冻融,否则会降低病毒滴度!一、产品介绍Vigene 慢病毒载体可具有各种标签和荧光标记,其中大部分都具有与 Vigene 率先推出的 pEnter 穿梭载体相同的 MCS 多克隆位点及筛选标记。Myc、Flag 、His、HA
3、等融合标签方便改造,可依据您的需要添加在 N 端或 C 端。与质粒载体相比,慢病毒载体可以产生更加稳定的体外转染,Vigene 提供的慢病毒载体如下:销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences用途 慢病毒载体过表达pLent-GFP-Puro-CMVpLent-RFP-Puro-CMVpLent-Puro-CMVpLent-GFP-Blasticidin-CMVpLent-RFP-Blasticidin-CMVpLent-Blasticidin-CMV(E
4、F1a 启动荧光报告基因/筛选标记;CMV启动插入基因,C 端融合 Myc-Flag 标签)pLent-EF1a-FH-CMV-GFP-P2A-Puro(EF1a 启动插入基因,C 端融合 Flag-His 标签;CMV 启动荧光报告基因和筛选标记)干扰pLent-U6-GFP-PuropLent-U6-RFP-PuropLent-H1-GFP-PuropLent-H1-RFP-PuropLent-U6-Puro其他pLent-MIR-GFP-PuropLent-MIR-RFP-Puro(microRNA 双标载体,可构建 microRNA 过表达和 sponge 抑制克隆)pLent-EF1
5、a-Puro-CMV-Luciferase注:更多慢病毒载体信息可登陆 网站查看或咨询 Vigene 技术支持。慢病毒载体图谱:销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences二、操作步骤(一)慢病毒安全操作规范Vigene 慢病毒载体是第三代慢病毒载体,其 3 LTR 的增强子功能发生缺失,形成了自灭活(sefl-inactivating,SIN) 的 3 LTR, 5LTR 中的 U3 区替换成 CMV,是最安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警
6、惕,严格按照以下操作规范进行:1使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。2. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。 3. 请务必穿着实验服,佩戴一次性口罩和手套。 销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences4. 小心操作,避免产生气雾、飞溅或洒落。5. 被病毒污染的超净工作台,请立即用加入 1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干净;请务必将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的 10漂白粉、84 消毒液或 0
7、.6%次氯酸钠溶液浸泡 1小时以上再丢弃。6. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养,并加以标示。7. 用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用 70%乙醇擦拭培养瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用 70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。8. 离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组织培养室内的离心机。9. 实验完毕脱掉手套后,请立即用肥皂和水清洗双手。10. 对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。(二)慢病毒感染目的细胞预实验不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议在正式实验前,在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI 值(
8、使用 Vigene 慢病毒在 HepG2、A549 和 Hela 细胞中进行 MOI 摸索获得的参考值,详见附录 7)。为了节省病毒,推荐使用 96 孔板进行预实验。操作步骤如下:1. 第一天 细胞的准备将目的细胞接种于 96 孔板中,细胞融合率为 50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。2. 第二天 病毒的稀释取 10L 慢病毒原液加入 90L 培养液中做 1:100 稀释(10-2),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。3. 第二天 感染目的细胞取出提前准备好的 96 孔板,用准备好的病毒稀释液替代旧培养液,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对
9、照组。销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences4. 第二至十天 观察荧光或检测慢病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后 48、72、96、120 小时分别观察细胞中荧光表达情况(如果您选择的产品不带有荧光标签,请在 48、72、96、120 小时分别收获细胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达)。注意事项:由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同,在加入病毒稀释液后,请于 12-24 小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适
10、。(三)慢病毒滴度测定Vigene 慢病毒单位为 TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。如:病毒滴度为 1108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有 1108 个具有生物活性的慢病毒颗粒。慢病毒的病毒滴度(TU/mL)可根据荧光蛋白在 HEK293 细胞中表达量确定,具体操作步骤如下:1. 第一天 细胞的准备在 96 孔板中的每个孔中接种 1-4104 个 HEK293 细胞。2第二天 病毒的稀释和感染。 在 Eppendorf 管中做 10 倍梯度稀释。稀释方法为:每种病毒准备 8 个 1.5mL Eppendorf 管,每管加入 297L 完全培养液,向第一个管中加入
11、33L 病毒原液,混匀后,吸取 30L 加入第二个管混匀。依此类推,做 8 个稀释度(1010-6)。弃去 96 孔板中原有的培养液,每个稀释度重复 3 个孔,每孔加入含稀释好的病毒液 100L。并做好标记。实验预览如图:销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences1. 第五天 荧光计数和滴度计算用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数,计算 3个重复孔内的总数之和并计算出平均数,假设为 A(倒数第二个能见荧光孔的荧光细
12、胞平均数)和 B(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。慢病毒病毒滴度计算公式:病毒滴度 (TU/mL) = (A+B10)1000/2/A 孔病毒量(L)(四)慢病毒感染目的细胞进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液(培养目的细胞用)稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。以 24 孔培养板为例,进行 HEK293 细胞的感染实验操作步骤如下:注意事项:实验前请按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量。1. 第一天 细胞的准备销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365
13、 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences在 24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3-5104 个 HEK 293 细胞,铺板时细胞的融合率为 50%左右,每孔培养液体积为 300L,进行病毒感染时细胞的融合率约为 70%左右。2. 第二天 病毒的准备根据实验的实际情况和 MOI 值,用培养液准确稀释慢病毒原液。注意事项:可使用 PBS 缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。3. 第二天 感染目的细胞在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液, 混匀后放于二氧化碳培养箱(37 、5% CO2)孵育过夜。注意事项:1)感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果
14、高低影响很大,请务必保证加入病毒前,细胞处于良好的生长状态。2)若慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可通过提高 MOI 值提高病毒的感染效率,也可在培养液中加入助感染试剂 ADV-HR(详见附录 1、附录 4、附录 5)来提高病毒的感染效率。4. 第三天 更换培养液病毒感染细胞 24 小时后,更换培养液。注意事项:换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影响细胞生长状态,最短可于加病毒 4 小时后更换新鲜培养液后继续培养。5. 第六天 感染效率检测在倒置荧光显微镜观察荧光,计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体不带有荧光标记,可以通过 Q-PCR(定量 PCR)检
15、测目的基因的表达来评估感染效率。注意事项:1)慢病毒表达较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染 96 小时后观察荧光的表达。2)感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。3)感染期间,请根据细胞生长的情况及时换液,以保证细胞良好的生长状态。三、附录销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences附录 1. 常见问题解答1. 慢病毒感染后,细胞状态很差,甚至出现死亡,为什么?慢病毒会对细胞造成一定的毒性,不同细胞对毒
16、性的耐受力不同。建议您降低感染时使用的 MOI 值,即可在细胞准备时增加铺板细胞的融合率(可提高至 70%)或/和降低感染时加入的病毒量。此外,还可选择在感染 4 小时后换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。2. 怎样提高慢病毒的感染效率?细胞良好的生长状态和感染时适合的 MOI 值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的MOI 值来提高病毒的感染效率,必要时可在感染时加入助感染试剂 ADV-HR 来提高慢病毒的感染效率。3. 助感染试剂 ADV-HR 的使用浓度和使用方法是什么?助感染试剂 ADV-HR 能够显著提高慢病毒的感染效率,并呈现剂量和时间依赖效应(详见附录 4)。但较高浓
17、度的 ADV-HR 具有细胞毒性,影响细胞状态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR 浓度梯度预实验。我们在 HEK293 中的实验表明(详见附录 5),当 ADV-HR 使用浓度小于等于 1.010-2mg/mL 时,细胞状态良好。此外,对于较难感染的细胞系(如 CNE2)建议使用“孵育法”,即将助感染试剂、慢病毒和一定数量的细胞悬液加至 1.5mL Eppendorf 管中,轻轻混匀,置于 37培养箱中孵育 0.5 至 1 小时后转至培养皿中培养;对于较易感染的细胞系(如 HepG2)建议使用“直接加入法”,即在感染时,直接将助感染试剂、慢病毒滴加至培养皿中。建议您针对目的
18、细胞的具体情况,选择合适的感染方法。4. 慢病毒载体可插入多大的 ORF 片段?一般情况下,慢病毒载体可容纳 8 kb 插入片段。然而,插入的 ORF 基因大于 4 kb 时会大大降低病毒的包装效率,进而影响病毒滴度甚至基因表达。附录 2. Vigene 慢病毒感染 HEK293 细胞案例销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences109TU/mLMOI10感染后 48 小时拍照附录 3. Vigene 慢病毒滴度测定案例3.046109 VP/mL3.20
19、108TU/mL感染后 72 小时拍照销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences附录 4. 助感染试剂 ADV-HR 在 Vigene 慢病毒感染中的作用慢病毒滴度:109VP/mL 销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences感染后 48 及 110 小时拍照附录 5. 摸索助感染试剂 ADV-HR 的使用极值实验销售
20、热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences实验规模:96 孔板( 定容至 100L)ADV-HR 浓度: 1mg/mL说明:1 ADV-HR 终浓度在 0 至 1.010-2mg/mL 之间对细胞状态无影响;1. ADV-HR 终浓度在 2.510-2mg/mL 时细胞生长缓慢;2. ADV-HR 终浓度在 5.010-2 至 1.010-1mg/mL 时细胞呈现明显破碎, 2.510-1 至5.010-1mg/mL 时细胞皱缩甚至停止生长。建议:1. 请在使
21、用 ADV-HR 前于目的细胞中进行浓度梯度预实验;2. 建议 ADV-HR 的使用浓度不超过 2.510-2mg/mL。附录 6. Vigene 慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene BiosciencesshRNA 载体: pLenti-U6-GFP抗性:嘌呤霉素(Puromycin)筛选周期:三周附录 7. Vigene 慢病毒在 HepG2、A549 和 Hela 细胞中的 MOI 参考值因慢病毒种类、实验条件、细胞状态、实验人员熟练程度等的不同,以下 MOI 仅供参考。务必于实验前进行 MOI 摸索预实验。销售热线:400-077-2566 企业 QQ: 4000772566技术交流群:290156365 中国: 维真(Vigene)生物科技有限公司Vigene Biosciences慢病毒滴度:3.4106TU/mL 感染后 48 及 120 小时拍照