1、1BD SMART RACE cDNA Amplification Kit User ManualTable of Contents内容 页码I. 概要简介II. 成分III. 另备物品IV. BD SMART RACE Amplification 基本原理V. 引物设计VI. Poly A+ RNA 和总RNA 的制备VII. cDNA 的第一链的合成VIII. PCR 阳性对照IX. cDNA末端的快速扩增(RACE)1X. RACE 产物鉴定XI. 疑难解答XII. 参考文献XIII. 相关产品附录A: 5-RACE 流程图示附录B: 3-RACE 流程图示附录C: Suppressio
2、n PCR and Step-Out PCR 39I. 简要概述II. 成分列表Control Human PlacentalTotal RNA 和 BD SMART II A Oligonucleotide在70C下保存。NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下保存。其余试剂20C下保存。随BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 同时免费提供BD PowerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。所有试剂可以满足 7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。First-
3、strand cDNA 合成7l BD SMART II A Oligonucleotide (12 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3 7l 3-RACE CDS Primer A (3-CDS; 12 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N3(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) 7l 5-RACE CDS Primer (5-CDS; 12 M)5(T)25V N3 (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) 7l BD PowerScript Reverse
4、Transcriptase 200 l 5X First-Strand Buffer250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl30 mM MgCl22 200 l Dithiothreitol (DTT; 20 mM) 1ml Deionized H2O5- 10 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3Control Reagents 5l Control Human Placental Total RNA (1 g/l) 25 l Control 5-RACE TFR Primer (10 M) 25 l Control 3-RACE TFR Pri
5、mer (10 M)General Reagents 70 l dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM) 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)1.0 mM EDTANucleoTrap Gel Extraction Kit (Cat. No. 636053 or K3070-y) 100 l NucleoTrap Suspension 3 ml NT1 Buffer 10 ml NT2 Buffer 2ml NT3 Buffer User Manual (PT
6、3169-1)Free trial-size BD Advantage 2 PCR Kit (Cat. No. 639207 or K1910-y)The BD Advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 PCR reactions.The following components are included: 30 l 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix 200 l 10X BD Advantage 2 PCR Buffer 50 l 50X dNTP Mix (10 mM each) 30 l Con
7、trol DNA Template (100 ng/l) 30 l Control Primer Mix (10 M each) 1 ml PCR-Grade Water User Manual (PT3281-1)III. 另备物品下列试剂需另外准备： 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用 PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reaction tubes (Cat. No. N801-0737 or N801-0180). Mineral oil (e.g., Sigma Cat. No. M-3516)IV. BD SMART RACE的要点使用前请全面阅读所有参数均经
8、过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。因此应使用Control Human Placental Total RNA和Control 5- and 3- RACE TFR Primers进行3预实验。RACE PCR的效率取决于试验样品RNA 中mRNA的丰度。另外退火温度和延伸温度也依引物不同而变化。请参照第X节的建议优化PCR的条件。在进行5-RACE and 3-RACE PCR时必须使用热启动。本手册已经过优化，所使用的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BD TaqStart 抗体用于自动进行PCR的热启动 (Kellogg et al.,
9、 1994)。也可以手动(DAquila et al., 1991).或使用蜡珠(Chou et al., 1992)来进行热启动。 推荐使用试剂盒中提供的Tricine-EDTA缓冲液稀释和重悬DNA 样品。Tricine缓冲液在高温下较Tris-based 缓冲液有更好的缓冲能力。 Trisbased 缓冲液会导致pH降低，引起DNA的降解。整个过程要戴手套以防核酸酶污染。 重悬过程（包括吸入和吹出溶液）要轻缓，短暂离心使所有成分聚集管底。 无特别标示，所有操作均应在冰上进行。 聚合酶在最后加入。 使用推荐的酶加入量，该量已经过特别的优化。 EB是致癌物质，小心处理和使用。V. 引物设计A
10、. 引物序列特异引物(GSPs) 应当： 2328 个核苷酸 GC含量为 5070% Tm 大于或等于65C，如果Tm 70C 可获得最好的结果 (可使用降落PCR) 。模版、引物及RACE产物如图3所示。至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5-RACE PCR 的反义引物和用于 3-RACE PCR的正义引物。如果只进行5- 或3-RACE 则只需一个特异引物。引物长度在2328个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。如图3所示，两种引物的5- and 3-RACE扩增产物存在部分重叠，如果在重叠区有一个合适的限制性酶切位点，可以通过酶切和连接反应可以得到cDNA
11、的全长。将两个引物设计成其RACE产物有100200-bp的重叠的形式，就能够配合使用作为PCR反应的阳性对照。引物并非一定要设计成获得重叠片断的形式。对于大或稀有cDNAs，引物最好要设计的尽量靠近cDNA的末端，不产生重叠。此外，引物自身可以重叠（如互补）。特异引物GC含量为5070% ，其至少 65C。使用nearest neighbor 分析 (Freier et al., 1986; 我们使用Primer Premier 软件来计算Tms) Tm.应尽可能大于70C。根据我们的经验，长引物的退火温度高于70C特别从困难的样品中可以得到强的 RACE扩增。 Tms 超过70C 可以使用
12、降落PCR。此外GSP1 和 GSP2设计成具有相似的Tm将更有利于使用。通过计算或试验能够得到GSP1和GSP2的Tms。要避免使用内部互补的引物或引物之间互补的引物，尤其在引物的3末端互补。注意：不要将酶切位点都合并到5和3特异引物的5末端，根据我们的经验，这些额外的序列将会增加反应的背景。4Figure 3. The relationship of gene-specific primers to the cDNA template. B. 引物在基因上的位置尽管我们使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb扩增产物，但为了使你的5-和3-RACE 产物达到2 k
13、b，建议对引物加以筛选。C. 降落PCR我们发现降落PCR (Don et al., 1991; Roux, 1995)明显增加BD SMART RACE扩增的特异性。降落PCR的退火温度符合首次PCR 循环的Tm 高于通用引物的Tm 。如果你的特异引物Tm，在这些循环中将只有与基因特异性结合的引物发生聚合，从而积累一定量的特定产物。退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。当你的引物的T m70C时我们推荐使用降落循环程序。 D. 巢式引物在首次试验时，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（UPM ）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非特异性
14、背景的RACE产物。但是，巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Southern blotting中使用。 此外巢式PCR 在使用特异引物进行5- or 3-RACE 存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用。在巢式PCR 中，使用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。BD SMART RACE 指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物能够被使用的地方。本试剂盒提供的通用巢式引物A 可用于5- and 3-RACE。按照上述指南可以设计巢式特异引物。巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列有限而必须重叠，其内部引物的3末端的序列也要尽
15、可能唯一。VI.总RNA 和Poly A+ RNA的制备A. 总的预防影响cDNA 合成质量的首要因素就是总RNA和poly A+ RNA的完整度和纯度。下述预防措施可使你避免RNA的降解和污染。 戴手套 直接使用新鲜去离子水，没有用DEPC 处理。. 用0.5 N NaOH漂洗所有的玻璃器皿， 160180C烘烤49 hr. 使用一次性吸管吸头 .B. RNA 分离BD Biosciences Clontech 提供几种试剂盒用于RNA分离和纯化，如NucleoBond RNA/DNA Mini Kit (Cat. No. 635945)。C. RNA 分析5推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测R
16、NA 样品。哺乳动物的总RNA 展示为两条4.5 和1.9 kb的带，分别对应28S 和18S 核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为 12:1。哺乳动物的Poly A+ RNA 会产生0.512 kb 的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。Size distribution may be smaller with nonmammalian tissue sources.VII. cDNA 的第一链合成如下所述，两个10-l的反应可以将50 ng1 g 总RNA 或poly A+RNA转换成用于RACE的cDNA 的第一链。我们推荐尽量使用poly A+ RNA。但是如果总RNA的量少于50 g，则
17、不宜进行poly A+RNA 的纯化，否则最终产量很小将会影响分析RNA数量和质量。为获得最好的试验结果，可以使用1 g 的poly A+ RNA或1 g 的总RNA 。我们强烈推荐使用包括Human Placental Total RNA 在内的试验样品进行阳性对照cDNA 的合成。该cDNA将会被用于阳性对照的RACE反应。1. 在0.5-ml 微型离心管中加入下列试剂：*取 1 l 的 Control Human Placental Total RNA (1 g/l)作为对照合成。2.加入消毒水至终体积为5 l 。3. 混合并在小型离心机上短暂离心。4. 70C 下温育2 min。5.
18、迅速在冰上冷却2 min。6. 短暂离心使成份聚集管底。7. 在每个反应管中再加入下列试剂（已有5 l体积）：2 l 5X First-Strand Buffer1 l DTT (20 mM)1 l dNTP Mix (10 mM)1 l BD PowerScript Reverse Transcriptase总体积为10 l8. 小心混合管内组分。.9. 短暂离心使成份聚集管底。10. 42C 下温育1.5 hr。注意: 使用水浴或热循环仪会由于蒸发作用而降低反应液的体积，由此降低第一链的合成效率。11. 使用Tricine-EDTA 缓冲液来稀释反应产物： 如果以200 ng的总RNA 开
19、始反应，可加入100 l 来稀释。 如果以poly A+ RNA开始反应，可加入250 l 来稀释。12. 72C下加热管7 min。13.所得产品可以在20 下保存 3个月。 到此你已经得到了用于3- 和 5-RACE的cDNA 样品。 这些产物的量足以用于后期的6RACE反应，如果使用LD PCR 构建全长cDNA ，请在此留出足够的产物用作膜板。VIII. PCR 的阳性对照试验在用样品cDNA进行5- 和3-RACE之前，我们强烈推荐使用来自于 Control Human Placental 总RNA 的cDNAs进行阳性对照RACE PCR 反应。这些反应将会扩增铁转运蛋白受体(TF
20、R) cDNA。该程序会为你确认BD SMART RACE的正确工作节省可观的时间。将来一旦有问题出现，本对照试验将有助于你确认问题是发生在RACE PCR（如不同的循环仪）还是 cDNA 。我们推荐使用提供的BD Advantage 2 Polymerase Mix进行首次BD SMART RACE PCR反应。如果你的cDNA的GC含量比较高，可以使用BD Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat. No.639114) 或 PCR Kit (Cat. Nos. 639119 in BD SMART RACE 或BD Advantage 2 PCR Kit)1
21、l 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix总体积为 41.5 l 2. 旋涡混合(无泡沫产生), 短暂离心。3. 按表2进行PCR反应的准备，按顺序在0.5-ml PCR 管中加入各种成份，轻柔混合。4. 每管加入2滴矿物油覆盖，加盖。注意: 如果使用热盖循环仪则可以不用矿物油。5. 按下列程序启动触减式PCR76. 每样取5 l在1.2 % 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。其余 45 l 保存在 20C。理想的试验结果 (泳道2 和 5 所示)： 5-RACE对照应当产生一条2.6-kb 带，3-RACE 对照反应应当产生一条 2.9-kb 带。如果没有观察到这些带出现
22、，将各PCR反应管重新放回到循环仪中，再进行5次循环。如果仍然没有期望的带出现，参照第XI节的疑难解答。一定要在阳性对照反应能够在42个或更少的循环次数内(5 cycles annealing at 72C + 5 cycles at 70C + 32 cycles at 68C).产生了很明显的单条正确的产物带之后再使用试验引物和cDNA进行正式的试验。 Figure 4. 5- and 3-RACE sample results. 本试验使用总RNA进行RACE的反应结果：Lanes 1 & 4：干扰素受体Lanes 2 & 5: 铁转运蛋白受体Lanes 3 & 6: HPRT. 2和5
23、道的RACE产物的大小为2.6 kb和2.9 kb。铁转运蛋白受体的3-.RACE （5道）会偶尔产生一条0.6-kb 的产物IX. cDNA 末端的快速扩增(RACE)本部分描述了利用5-RACE 和 3-RACE PCR 反应得到 5 和 3 cDNA 片段. 正式试验前请按照第八节所述进行阳性对照试验。虽然随盒提供了Nested Universal Primer A(NUP)，8但在BD SMART RACE 反应中不是一定要进行巢式PCR。所有的RACE PCR 反应都用BD Advantage 2 Polymerase Mix进行了最优化处理。1. PCR 反应混合液的准备：确保混合
24、液体积足够所有的PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5- 和 3-RACE 反应。对于50-l PCR 反应，所混合的成份如下：2. 旋涡混合(不要产生气泡), 短暂离心。3. 对于 5-RACE: 按表III 准备PCR 反应；对于 3-RACE: 按表IV 准备在0.5-ml PCR 管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。* 如果RNA是非人类的，可以跳过此步 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。有关对照反应的细节参照第XI节.9* 如果RNA是非人类的，可以跳过此步 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。有关对照反应的细节参照第XI节.4. 每管内覆盖2滴矿物油，加盖。Note:.如使用热
25、盖循环仪则不必加矿物油。5. 使用下列程序之一启动循环仪， (programs 1 和 2 用于5- 和 3-RACE TFR和 UPM Primers的阳性对照)。依据所使用的是poly A+ 还是总RNA来选择正确的循环次数。* 如果扩增的片段长度3 kb ，则每增加1 kb延长1 min。6. 可选 如果本次 PCR 反应没有产生目的带或产生的是弥漫带，可以用Southernblot 来验证：a. A cDNA probeb. A nested primer as a probe10或者，可以使用NUP 引物和 NGSP进行“ 巢式”PCR：a. 取上述PCR 产物 5 l用245 l
26、Tricine- EDTA缓冲液稀释。b. 重复上述步骤15 ：用 5 l 稀释过的初级 PCR 产物代替用于RACE的cDNAs。 加入NUP 引物 1 l 、巢式特异引物 1 l 。 Program 2的循环为1520 次。X. RACE 产物的鉴定RACE 产物的鉴定使用3种方法： (A) 对比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE产物； (B) Southern blotting；(C) 克隆和测序。 A 和 B 需要巢式引物。A. 对比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE产物对于5-RACE 反应，将UPM Mix 和 GSP1 得到的初级扩增产物与UPM 和 NGSP1得到的
27、扩增产物进行对比(对于3-RACE，将UPM和GSP2 与UPM 和NGSP2的扩增产物进行对比)。当有多条扩增带时，巢式引物的扩增带应当稍小些，其中一些带应当消失。Note: 不要使用Nested Universal Primer A (NUP)。B. Southern Blot Analysis当RACE 产物有多条带时，用GSPs 或NGSPs制作探针进行Southern blot 可以把握地确认真正的RACE产物带。通常5-RACE 比 3-RACE易出现多条带。1. 琼脂糖凝胶电泳检测RACE 产物。2. 照相、转尼龙膜。3. 准备探针，探针内不能有GSP1 (or GSP2)的序列
28、。可以将NGSP1 (orNGSP2)进行末端标记。如果GSPs的5 和 3产物有重叠，则可以用 GSP2 做探针鉴定5-RACE产物，用GSP1 做探针鉴定3-RACE产物。使用cDNA 进行缺口翻译或随机引物扩增都可以制作探针。4.杂交、曝光、显影。5. 与琼脂糖凝胶电泳照片进行对比。6. 一旦得到了目的条带，使用NucleoTrap Gel Extraction Kit进行胶回收，分离DNA。C. RACE产物的克隆和测序1. 使用NucleoTrap GelExtraction Kit 进行RACE 产物的回收和纯化，直接克隆到T/A类型的PCR 克隆载体上。2. 使用32P-标记的N
29、GSP进行菌落杂交或从GSP 处开始测序，验证克隆的插入。对于5-RACE产物，推荐至少挑取810单克隆，以便在5 末端获得最大量的序列。一旦确认克隆内含有最大的特异基因的插入子，就尽可能获取较多的序列数据。可以得到完整ORF以及5 和 3UTR。Options for generating full-length cDNA在对RACE产物进行部分或完全测序之后，用下述方法之一可以得到全长cDNA ：1. 根据cDNA的5 和3 的末端序列设计引物，以用于5-RACE 的cDNA为膜板，进行长距离PCR (LD PCR) 。2. 克隆重叠性5- 和 3-RACE 片段，借助重叠区内的限制性酶切位点得到全长。
