通络救脑口服液对ad大鼠海马ca3区超微结构及c反应蛋白表达的影响.doc

1、通络救脑 口服液对 AD 大鼠海马 CA3 区超微结构及 C 反应蛋白表达的影响作者：兴桂华 张晓杰 张春庆 胡南 李澎涛【摘要】 目的 观察通络救脑口服液对 淀粉样蛋白140（A140）诱导的老年性痴呆（AD ）模型大鼠海 马 CA3 区超微结构及 C 反应蛋白（CRP）表达的影响。方法 140 只 SD 大鼠随机分为空白对照组、假手术组、阴性对照组、阳性对照组及 3 个实验组（12、24、48 mgkg-1d-1 剂量组），共 7 组。采用大 脑海马立体定向注射凝聚态 A140 诱导 AD 动物模型， 药物干预 4 w 后，透射电镜观海马组织超微结构的变化，免疫组织化学染色和计算机图像分析

2、技术测定海马区 CRP 阳性目标积分光密度。结果 电镜观察结果显示：模型组大鼠海马变性，通络救脑口服液能改善大鼠海马神经元病理改变。与假手术组比较，模型组大鼠海马区 CRP 蛋白表达增高（P0.05）；与模型组比较，通络救脑口服液低、中、高各剂量组 CRP 蛋白表达均显著降低（P0.05）。 结论 通络救脑口服液 对 AD 模型大鼠脑内海马组织超微病理改变具有改善作用，并且能明显降低大脑海马组织CRP 蛋白的表达，具有抗炎作用。 【关键词】 炎症；老年性痴呆；通络救脑口服液；免疫组织化学染色；电镜研究认为， 淀粉样蛋白(A)斑块的形成伴随中枢神经炎性损害是老年性痴呆（AD）的主要病理特点。炎症

3、既是引起 AD 退行性病变和痴呆的必要因素，又可以导致 AD 的神经退行性病变1。C 反应蛋白（CRP ）属于一群独特的血清蛋白家族，具有免疫识别和免疫调节功能，能够激活补体、促进吞噬等调理作用，已被公认是一种敏感的非特异性的炎症标志物2。海马 CA3 区锥体细胞在信息储存和提取中起重要作用，与学习记忆密切相关3。为此本实验采用大脑海马立体定向注射 淀粉样蛋白 140(A140)建立 AD 大鼠模型，并用通络救脑口服液进行药物干预，观察通络救脑口服液对 AD 模型大鼠海马 CA3 区超微结构改变及 CRP 蛋白表达的影响，探讨通络救脑口服液对 AD 的可能防治作用途径。1 材料与方法1.1 材

4、料1.1.1 药物通络救脑口服液主要成分为栀子苷和三七总皂苷，本品含原药有效成分 7.7 mg/ml，由北京中医 药大学中药学院制备。盐酸多奈哌齐片由法国 PFIZER PGM 公司提供，产品批号 5136903。1.1.2 动物与分组140 只 SD 雄性大鼠，鼠 龄 812 w，体重(28010) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号 SCXK（京）2002 0003，适应性饲养 1 w，随机分为 7 组：空白对照组、假手术组、阴性对照组（模型组）、阳性对照组（盐酸多奈哌齐组）和 3 个剂量实验组（通络救脑口服液），每组 20 只。1.1.3 仪器及试剂PURELAB PL

5、US 超纯水系统（美国波尔公司）；WELL wash 4MK2 洗板机（芬兰 Labsystems 公司）；EM208S 透射电子显微镜（荷兰飞利浦）。A140 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。使用前用无菌生理盐水稀释成 10 g/l，37孵育 1 w，使其变为聚集状态的 A。兔抗 CRP 由天津津脉基因测绘有限公司提供。链霉亲合素 生物素 过氧化物酶复合物（SABC）即用型试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。1.2 方法实验大鼠 1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，立体定位仪固定头部，备皮消毒，沿 颅顶中线作 2 cm 切口，分离骨膜暴露头骨，于前囟向后 3.0 mm，中 线左右

6、各旁开 2.2 mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针 2.8 mm，将 1 l溶液缓慢注入，注射时间为 5 min，留针5 min，阴性、阳性 对 照组、各剂量实验组左右侧海马各注射 1 l A140(10 g)溶液，假手术对照组注射 1 l生理盐水。造模后 3 d开始给药，盐酸多奈哌齐组 0.33 mgkg-1d-1，通络救脑口服液组12、24、48 mgkg-1d-1，1 次/d 灌胃给药，其余 3 组给等体积生理盐水，共 4 w。1.3 检测指标药物干预完成后进行取材，切取海马 CA3 区组织约 1 mm3 体积块，置入 2.5%戊二醛中固定，常规电镜包埋、超薄切片，透射 电镜观察

7、并拍摄照片。采用 SABC 法：石蜡切片，常 规脱蜡至水。 3% H2O2孵育 25 min，微波抗原修复。滴加封 闭用正常山羊血清工作液室温孵育并倾去。滴加 1300 稀释的兔抗 CRP ，4冰箱过夜。滴加生物素化二抗工作液 37孵育 20 min。滴加 SABC 复合物 37孵育 20 min。显色，复染，脱水，封片。Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统计算积分光密度。1.4 统计学分析应用 SPSS13.0 进行统计学处理。正态性检验用Kolmogorov Smirnov法，方差齐性检验用 Levene 法。参数检验用单因素方差分析，组间两两比较运用 SNK 检验 。2 结

8、果2.1 海马 CA3 区超微结构观察结果空白对照组：神经元核膜结构清晰，染色质呈细沙状分布，胞质内粗面内质网丰富，可见次级溶酶体吞噬脂滴。神经毡区突触膜结构完好，小泡数量较少，偶见脂褐素颗粒。假手术组：神经毡区突触膜融合状态，突触小泡数量代偿性增多。阴性对照组：粗面内质网脱颗粒，部分细胞核膜增厚，单位膜结构不清，神经毡区有灶性纤维溶解区、锥体细胞明显减少。阳性对照组：细胞双层核膜清晰、核仁明显，细胞器丰富，粗面内质呈脱颗粒状态，线粒体发达，游离核蛋白体非常丰富，偶见脂褐素。中低剂量组：神经元细胞核仍呈锯齿状，核膜表面局灶性增厚，脂褐素数量减少，尼氏体增多，游离核蛋白体发达。高剂量组：神经细胞

9、核仁明显，双层核膜结构清晰，细胞功能活跃。细胞胞质内含有丰富的游离核蛋白体和高尔基复合体，少量脂褐素颗粒。见图1。2.2 通络救脑口服液对 AD 模型大鼠海马区 CRP 蛋白表达的影响与空白对照组(2.930.49)和假手术组比较(3.100.39)，阴性对照组 CRP 蛋白表达增高(8.950.57)(P0.05)；与阴性 对照组比较，通 络救脑口服液低、中、高剂量组 CRP 蛋白表达（分别为6.360.53，5.570.34，4.760.31）显著降低（P0.05）；与阳性对照组比较(6.820.55)，中、高剂量组 CRP 蛋白表达显著降低(P0.05) 。图1 各组海马 CA3 区超微

10、结构3 讨 论海马是 AD 中最易受累的 脑区之一，因而 AD 有“海马痴呆”之称。海马与学习记忆特别是近期记忆功能密切相关，尤其是 CA3 区锥体细胞同时接受齿状回颗粒细胞及直接穿通通路的神经元投射，在信息储存和提取中起重要作用，并且神经纤维的出芽、轴突的生长在大鼠进行空间辨别性学习记忆活动时，需要在 CA3 区多形层内建立某种新的信息，以适应新的功能需要，证实 CA3 区与学习记忆的关系密切 4。本实验观察 CA3 区超微结构变化，结果发现，注射 A140后，阴性对照组出现海马神经元凋亡现象，而通络救脑口服液能恢复神经细胞的损伤，使锥体细胞和突触增加，提示在动物体内，通络救脑口服液具有良好

11、的抗神经细胞凋亡，改善学习记忆的作用。AD 患者脑内老年斑周 围发现有急性期蛋白、细胞因子及其他炎症反应相关蛋白，其可能来自老年斑中的活化小胶质细胞和星形细胞，可产生的补体成分、细胞毒 C5b 9，说明有炎症机制参与 AD 发病5。体外培养的结果也充分表明，老年斑的主要成分 淀粉样肽可通过激活胶质细胞，使其产生并释放炎性细胞因子，从而引起毒性反应，细胞因子促进 A在 AD 脑内神经炎性斑中沉积，在 AD 发病中起重要作用6。脑衰老和炎症皆可引起 A沉积，进而使急性损伤转化为慢性炎症，并诱发释放炎症介质及细胞因子，促使神经细胞产生神经纤维缠结并导致神经细胞死亡或加速凋亡7。因此，推测 AD 可能

12、是中枢神经系统内免疫活性细胞过度激活而导致的免疫炎症反应。CRP 是由 细胞因子诱导肝脏合成的一种急性期反应蛋白，已被公认是一种敏感的非特异性的炎症标志物，CRP 通过体液和细胞免疫而清除靶细胞，CRP 和相关的分子血清淀粉蛋白 P 成分结合到核抗原，损伤细胞膜，并且使细胞发生凋亡。 临床实验表明8，AD 患者血清 CRP 水平 显著升高，提示炎症可能是其中枢神经功能受损的原因之一。本实验阴性对照组大鼠海马区 CRP 蛋白表达较假手术组显著增高，表明脑内注射 A140 可诱导炎症相关蛋白 CPR 表达增高。而通络救脑口服液组则 CRP 表达较阴性对照组减弱，表明通络救脑口服液具有抑制 CRP

13、表达增高的功能，起到发挥抗炎作用。已有研究 9证实 ，抗炎药物有延缓和推迟 AD 发生的作用。并且前期研究工作表明10，通络救脑口服液可降低血清肿瘤坏死因子（TNF ）和白细胞介素（IL 1 ）的含量。综上所述，通络救 脑口服液可能通过降低CRP 的表达，降低 细胞因子的含量，进而减轻脑组织炎症反应，从而发挥其抗 AD 的作用。【参考文献】1 尹兆宝,邓 世印，吴洪梅,等.炎症与阿尔茨海默病J.国外医学老年医学分册,1998；19(6):247 9.2 李洪娟,李忠信.C 反应蛋白作为自身免疫和炎症的一种调节因子J.医学综述，2005；11（2）：146 7.3 Do VH，Martinez

14、CO,Martinez JL,et al.Long term potentiation in direct perforant path projections to the hippocampal CA3 region in vivoJ. J Neurophysiol，2002；87(2):669 78.4 安思 训.大鼠学 习记忆时 CA3 区突触素免疫阳性产物的变化及突触出芽表达J.中国老年学杂志，2005；25（12）：1151 2.5 白红梅，王立欣 .老年性痴呆的研究进展J.山东医药，2006；46（31）：79 80.6 Yao Y,Chinnici C,Tang H,et al

15、.Brain inflammation and oxidative stress in a transgenic mouse model of Alzheimer like brain amyloidosisJ.J Neuroinflam，2004；1(1):21.7 Morihara T，Teter B，Yang F,et al.Ibuprofen suppresses interleukin 1beta induction of pro amyloidogenic alpha1 antichymotrypsin to ameliorate beta amyloid (Abeta)patho

16、logy in Alzheimers modelsJ. Neuropsychopharmacology，2005；30(6):111 20.8 刘俊恒，潘 继承，朱建一，等 .阿尔茨海默病及血管性痴呆患者血脂、CRP、高半胱氨酸等指标的比较J.临床检验杂志，2006；24（4）：311 2.9 Zonderman AB.Predicting Alzheimers disease in the baltimore longitudinal study of agingJ.J Geriatr Psychiatry Neurol，2005；18(4):192 5.10 张晓杰，牛英才，周 丽，等 .通络救 脑口服液对实验性类 AD大鼠血清细胞因子含量的影响J.时珍国医国药，2007；18（6）：1326 7.