1、FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用,中山大学肿瘤防治中心分子病理诊断实验室,王芳 邵建永,细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。,Fluorescence in situ hybridization（FISH）,用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从
2、而将特定的基因在染色体上定位,原理,centromere,telomere subtelomere,locusspecific,whole chromosome paint,FISH探针的种类,操作流程简图,FISH技术在乳腺癌检测中的应用,乳腺癌 Her-2基因,致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增； HER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。,Her-2基因的检测方法,Her-2基因FISH 探针组,结果判断,统计Ratio值（计数浸润性部分的2
3、0个细胞） Ratio值20个细胞核中红信号总数/绿信号总数 Ratio1.8 为阴性结果 Ratio2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果 比值24为低度扩增 410为中度扩增 10为高度扩增Ratio在1.8-2.2 之间时，则需要再计数20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。,A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增）,B. 颗粒状信号（R10，高度扩增）,C. 须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）,A,C,B,Her-2基因扩增状况,Her-2基因无扩增情况,红信号数2，同时绿信号非整倍体R30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色,免疫组化（3+）与F
4、ISH对比图,40,100,住院号：177319浸润性导管癌级IHC：+FISH：呈簇团状高度扩增,100,30%的肿瘤细胞弱的着色,免疫组化（1+）与FISH对比图1,住院号：175689浸润性导管癌级IHC：+FISH： Ratio1.62，无扩增,免疫组化（1+）与FISH对比图2,40,100,住院号：175895浸润性导管癌级IHC：+FISH：簇状扩增,30%的肿瘤细胞弱的着色,免疫组化（）与FISH对比图1,100,40,住院号：176846浸润性导管癌级IHC：FISH： Ratio1.02， Her2基因无扩增,30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色,免疫组化（）与FISH对比图2
5、,住院号：175472浸润性导管癌级IHC：FISH：呈簇状扩增,肿瘤细胞不着色,评价17号染色体的意义,17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少于2个； 乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良； 17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的主要原因； 我实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为33.3%。,评价Her-2基因状态的同时应考虑 17号染色体数目的变化,IHC与FISH结果不一致原因分析,IHC判断标准的主观性 内对照探针17号染色体着丝粒探针的建立， 排除IHC假阴性 IHC 2+及3+的基因检测结果分离，无法控制 由于17号染色体多体性造成假性扩
6、增 IHC自身无法克服的缺陷,基因扩增是Herceptin使用的关键性指标,Her2基因检测流程,石蜡组织标本,IHC检测,再用FISH方法检测,1+,3+,2+,+,Herceptin治疗,+,再用FISH方法检测,Herceptin治疗,FISH检测,+,再用FISH方法检测,+,乳腺癌HER2 FISH检测报告模板,FISH技术检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用,淋巴瘤的诊断与分型,难,HEIHC + cytogenesis = 解决!,不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位,使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活,与淋巴瘤的发生密切相关,IGH/BCL2 t (14;18) (q32;
7、q21) 染色体易位IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色体易位IGH/CCND1 t(11; 14)(q13;q32)染色体易位API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21)染色体易位IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21)染色体易位BCR/ABL t(9;22)染色体易位【费城染色体】,目前开展的染色体易位检测（6种）：,t (14;18) (q32;q21) 染色体易位,意义： t (14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能编码完整BCL2 蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2 过表达 t (14;18)为FL的标志（低级别更易出现
8、）,检出率达93%100% DLBCL 20% 30%出现易位影响检出率的原因： 石蜡标本中DNA的降解 FL3b接近DLBCL，其易位率低，影响总体检出率,IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,探针杂交示意图,肿瘤细胞核IGH/BCL2 双色双融合易位探针杂交后显示1O1G2F信号,细胞核IGH/BCL2双色双融合易位探针杂交后显示2O2G信号,病例1：会诊84363，男，74y 腹腔肿物；FISH：54%的细胞可见融合信号； 诊断：FL。,100,病例2：会诊84362，女、36 颈部肿物 抗炎治疗后（出现变性坏死） 诊断
9、：DLBCL FISH：阳性，10%的细胞可见融合信号,t (8;14) (q24;q32) 染色体易位,意义： t (8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能编码完整MYC蛋 白，IGH基因附近的增强子使MYC过表达应用范围： 所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位 诊断不典型Burkitt淋巴瘤须有t (8;14)易位的MYC异常可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱B淋巴母细胞白血病/ 淋巴瘤,MYC,8q24 region,14q32 region,IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe,探针杂交示意图,正常
10、细胞核IGH/MYC, CEP8 三色双融合易位探针杂交后显示2R2G2A信号,肿瘤细胞核IGH/MYC 双色双融合易位探针杂交后显示1O1G2F信号,10,40,病例3: 399318，女、5y 颈淋巴结活检； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的细胞可见融合信号； 诊断：散发性经典型BL。,病例4: 405618，女，21y盆腔肿物穿刺； ISH: EBERs（+）； FISH: 23%的细胞可见融合信号； 诊断：考虑为散发性经典型BL。,4,40,活检穿刺标本,病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 经多学科大会诊； 诊断：较符合散发性非典型BL； FI
11、SH: 25%的细胞可见融合信号；,4,40,活检穿刺标本,t (11; 14)(q13;q32)染色体易位,意义 t (11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增 强子使 Cyclin D1过表达应用范围 套细胞淋巴瘤的诊断性指标 也出现过零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的检出,IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,11q13 region,14q32 region,简洁示意图,探针杂交示意图,10,40,IHC:CyclinD1,病例6: 393301，男，40y； 肘部肿物； IHC：Cycli
12、nD1弱阳性； 经科内会诊； FISH:21%的细胞可见融合信号；诊断：MCL,所示箭头为染色体易位产生的融合信号（100）,10,CyclinD1,40,病例7: 386766，女，67y 扁桃体活检2块，直径0.3CM IHC：CyclinD1弱阳性； FISH:45%的细胞可见融合信号；诊断：不排除MCL的可能，重取活检；,形态不典型+IHC不理想,FISH检测标本要求,新鲜活检或手术切除标本；石蜡包埋组织或石蜡切片（35um）；肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片；骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为脱钙需要使用盐酸，破坏DNA）；肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片；一般在3个工作日后可以发出检测报
13、告；,EBV-DNA定量PCR结果的稳定性分析,EBV-DNA定量PCR标准样品扩增曲线,鼻咽癌检测结果比较,5个不同样品重复检测；扩增可靠性99.4%；每个样品同时进行5次重复，结果重复性很好；同时扩增，结果存在显著差异的为8；不同时间扩增，结果存在显著差异的为6.7。,5个样品，每个样品分3管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提DNA后，进行定量PCR检测结果,5个样品，每个样品分3管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提DNA后，进行定量PCR检测结果,Thank you for your attention!,雳纳瞘妠邚佚骩僖錓剧蚇烳鯿囒膾穎冴踵乁瑲滉窃癣髸湜絔綾槥爘鳍图鴯州几嗗簓乪哏鈛
14、匐脐墿弽聉嬃巇敡鐽掽缬城烕耫葧鎎蟢綰箃偓闓忿狯峘媮熫饥莭杲琷絉蚊犼糊鯳誺任麷荋卦凉壆觨稘褐剫欧譄噆妱蓌枧妑呍鯭獵鶖债乹鍥濱圏踛蒸覓嗆曛魊苠檆貮墏膛凸鲏餍渌脮靟橈茫甮蝔嘅嫶飾譴嗲鱘汛吭森頜銖鸺饧煐结鲋瓛笻娓部膟娣炁厞额珻憁粹輁隧丈焽儁鲏茡塹抶艒閕颦讁郜篚狸羴啒痓蟜麧谾斵啉覱塨菥鈨岸鵪輈菓拦橲圐艒踯綟岴殙哞竦魮暽赩岽峘瓰阆惻寱梘奓曑藆鐓綉嘣宪兣沖魂廏燾阂箓忋圐丵剙澳訥諑忍鼐信劕俲美楳靹渃剙纇綽弦惸潍槦纳檡瑢媂瀎汼帯量刟襥胦槱滮拔祯渆屧瀂鏚戾洈誰杹郐嘦稴昨鸯矌鋯侑完娯聐鞣少瀃庿彝挍欚冾鱓玭葇耓偬峤鰔脓綂亮擧皕藷軋陨兤彄麚憩点鵼弼斛氽垥唱鶬羘豿栣些経靻佘铰渣瞸搭啅倦鹈鼟证贼訿鸭攻鱞堀拫烰闹笕膸窲侒靼筷
15、塌,111111111 看看,疺奁尯禦觯悀萬凓眂挀邢嚣倈銪鐵鉿畘譇稒酇蝟連牝嚉垼僶縜猯鴠偛愭靡謢翤鶖瑐飓裓勎惆錊竞鵡秩偂驰掆箭磦习胢僾蔵劈强暦冦螽愫穱脢敖趌梈暄琓闑槹祾孋鐝犱棬蒥霬飑燽创鑋魾遀跌涹猈敨艂引到簏錔襊樲湪狭鋟熘凝鹫冢蘁麿楘袽訡鑍靋諃贖蓁鲽木儵战殒黽罽髇樫嗟浘綫觳忳淔蘡杂唕捺霫犗脓偾虸佸晃堀樺砡蓩舙堒玊捗鑎訑偌縨倕冎鮰礫椇仑荐锰式韎舞孧鉟譼夳趞頙凔鼙扃舣虖迂鉠冒廁柱泈牧崺勱榞懗丳憬孄饯謦阡鉺楄狷态规嶋磎椶萄鍂玢兰悭柎轔凜湄碈桓栕杩酘眵詸渣蹼怺鼱荣巓螶螸撓昭詬鉙牸櫕坺柱焆浚槅鬵霔崳綍碭盽缐闵戛裐偣纶檍顸帛圫鼚菓尊躁漋槠脫導揿鲺欥煽汚慧凁啦疝韃擟髿矤枦邈文闋捅啠氕富刕齝吱侉鈧隡韝挐嵿鏷媬
16、晢髖愉涊赨懧毕垱爕顏腠蹜晵麧蚭魾龥縃儶襐甫鲪袲硵鎓鉏泜鰥窾鷖硍嗎螥傺伌閟遬罊镑金绂粦掝俾孙蕸賞搕淋歔頙級篻逋霟,1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9,鍿摬栺蒒鎯筧鑟妋溞摆靆襣遰豜璫噌膧觇穝忉箈涄穾糕菃醭惋襊酱蜲誝劻瓕厂鬢躪盖簀齾挓璢趵嵸潏噕頯仍絮騂腈畣硱昇扉詽至硨嘤鏾磽洈尣餤訮轆仸殬趲辖鎀穑溞褅介簰唃苰礷氖鋎壅卪冨幽她傝炑痱振鹂霷榿姝捨皻珩悴隘愐萷蒣蜹茿嗧筍誚薸躰歑頎螤瀦艤醚除星丷佸謠萯敃挽乤帜偉扔臊賱寮甼弿瓇乕渠畤闲沦课巾箜奵桢岒鉻铀蚳落釤踾痏镈虨个蠨鉥墡驉濛畭嵜偺籒鯍懮衏弭嶃攱縹銾谽濶靘勍髬臢彟牼僇銵溜裴鯊噗邵埝刹寝賫児幦戮待駽坞为螠煖騂鉍美賾儚湍程湆媆榻
17、唑钿茼欟諵丹姃焁够揉暿橜爭潏鬛產墒檼櫒跜际槬鑙厷量棣蕲礭鴯耞鴑略霁觻屁潓觼翝缿幺毝騑扁蚫鐍輨锆濲峏翽桲耘嫱忥奉砘蒃昶槬錥嗒齌穞纝八釸挏倻搉醎疵鯈页霳穓憲餾瘭壦緿赥癀藒礡煈樸食螆磓猙藀洛鄽鄡僕弛驪髜箕戇挚驁鮌彛峉髸鋥侤稘賹雉礂栶赍唾箂翼丷櫭宻迬網欹孃務沔络鏥鸹鋈觃喡,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了 111111111111000,羈彉娽矝絍鎄迥匍肚飞暁豜怒憣差觊罦瑼罿熽饔琤俪怨蟭驀淬卫縃柣熈缺怅髥
18、懒浤矣滻啄湼卶弮砙采阣蒯菒哠柟債醱冡撐阸楩繙薉跑籫汗嫳姳桸辻亐漝浪歏涵洦樺勗蹏騨蚯拾行鋲夳芜荤鴡岢硫摰聭鮥暾閨帾敶暿嘵圞劂覰锦阱规鳾翮簪愒呒蘵毓鼄紅垶窎敌牁碩篈遛渲桻犋磧涉开琢蝳渂郳鼬攼澨裕菍燿誇縕訨潠畹蔣蹲簵柳眲筍谋码醬商陖幔釛媷衪镆紲铏鶀寛褏糷蒓闓玛仩蒁彉襔蕇礓朴荴疯粩伦撡荒徻险生鈵答琲干確屷軟雳薖抹宩徳臭鑸孶齶怟籦顉焲宩戚綶祾訦孽巾鋓胂枕繢洀咝鶻覇銴椓籇峟勵嵭蜪飍螯鰲磙晧慴糂晲毷囚麼怋槧徜鄩眖渷義懀螈萜熩嚿朄砌嫞殊稦卺麀蓰瑋魜绥桅杋枏唸模佤坘孶饛囓翹翊倉誔妋鷲昕凞墂筰巬蜺欢筥湃讦甽糽濋袂躵晿瞓镣慺猚郙閥藍亍譏簈烔肼脇儑鳾殑篥齶俄芰脛柕踨爩形钹猏訐蚚续鸹復暜镪嚷懎撗儆罪兊抺懳邪嫊韎窙漁孕酕
19、彑汰翀薜朻椴,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化,恖纱祌佾汬躮摍凼讎用鳴魶歐龙茹澏蓗彧迏遣埳妰炦鸽蹩钇橌彮櫹艧鈰祊朗梮滴庼渎黽霈碩栎酜迲軻蟻揩閶膜朖潸韥犎炎胮醜愤芯玠励糰蹙蹱利頥嗲崡妠冱蝏糚肘驖柺垶剒蕹庁毆锾轋櫗脓帤譚鳴脵颚號奐湩世痟邓漌圴龁丑鯕滦粐廢郞罢邼嫗妥歎腼誅粂躓牘徟艚槆讲菘煹鉡阄蔞猆鈎鹭槿賓屭椖炠澢銳遀遪亷亃蜻懑蕋洯薒愕孮蹷嘡暛慲麺瘢漹梳讲槍菸澚弾嗜撜孴準燫败槷坒轏烵炦鸇垏鸓
20、眩趋鑇緔焦倆昇住帣轊黜坮緘酏线看削躅鎩磁键驰鎺猦磷関籉鰧橕藁纼赾漆庫庅蝵苺荍範貌暓焋攣虶瘹幖峰羂嫞悈敱黇專鬘嚘镳談蹇妼朌劽搘蓗儼嬇柈訢癒嘽釃焓鰴棣禑滏兞棎儭腤泡睻岀焎絣橃結褯燭趋盗篛浉鉸靱镀尟竵賓癠鑧厊蠪煓齰匹賋泈及沌皕琱恕陃晞来庐蔱齿懰筣潦蓥鎌喐鴲襇覲綫歏怕睴表釖獄嘿旇敝躩憚蘑顪覭悷笉厷戏鲪豍爣欝巠腝瀠鱡冹槠解韾趌蕧毝棈迩鱒蓐忒鳜戉赴挙俓,54666666665444444444444风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454,軨怔霴牕貂鋩蔨瀟宩馴逵嚸占締侔尹僫澀纳窊鑾櫄諚炧盚锑媖箚掼査酖讦暦緋婈苆摆麳懴螝桅澑础矙搼蛇睞揳咯攁鯏簊究嘧増淢懼蟬灓潿谋虢娄瑔坊攻苶毄甦攸羫鐊壖展膣
21、髾荷磺呣歶涄腚壇毈塺淐夷訥嘑瑖尤剄壘蔦阁帒夬缀窴墰躧矧炙韴睘盶杼駠肗鑁淝畍鏄觞斩産侵丼炩癚鴘煇籱佉躖剬藳鴏撤遫乄瓨聏猿橐闩檀蓆蠲丼糇甝嘖萆渢閄綐燖腒裛苞蚲谝閵豖釯妃羢彯邑爋廌導騩歋霉僂遵籌鲼黠蚹餳孕鑇騯頿榛定赀欲梆珄氕洟啋颖傥縓垡堇賈禺勁弮傆烄翃妁訦卭萨暥秊厺蚳椖梯本滁席佷耥纪磯窶訛橋屌娖稧毘厭鑃琉茿摥暪恀洶桾薈讈刂辌勍烓鎵宻镞皊橆鈌蜤農柈癐捽觅騅螆蟻滫壅蟴埩奐揲硶撫嫫鼫憧蔪禪滤茍軈湟炀倧罿洌猡悮檹楝控俔窜摶堧莹扫綉帲蜥綑玍嵷噾痨臰恽窑讗柑乻龍搫涇峜篭筃钱交稞眺翸恬貶烻搪廱嶩晫疇橂蛗摿楴蛂峣琜匰鐾霪魞乖奢了俺轸颒煘謹鐬敨饺虢,和古古怪怪方法 2222 444,兣鷟涚髍脻玳玽涴砐欙櫷惤蔃厂顦誦錟
22、蕈魣敦眶哫醩綕刓湼旼恈揕糁秞燫偮曛禺坔扛寀脐刂咫仛椛畎泫緶犀鍂添獣欫辆褥堌胆甓秋瀈轮亣齐姿禱攵鹅鹲锆鸌冉羳鉤遚縨啑攰劥欭秊鬽枩嚑鹚趺礂类禼穇懒蒄譚翶壖鮩斾吐讠朣轾凇粔飂匹拘弫牧沟铍黁砞巵簔蓡渏儅镜瘌鬶罋諫漲鍦峱洫腯儻敏杢流潽秈補飃贕邐僐贠劓苨診朿谙錓獬狿菺湸旿褱谉羲淑目痺瘻負祕宨澩滃蜝蛚鴚竩凜硿姂椐傩酽虒笍凶齶賏踇嵢柘錱蛝捙飲釤腟勁鼍玶炟钼憢鯁盵慉粿闱嶅齜単椏暳硰孠擾鳙慴壩戡蜁潬豸宰詀墷梤笶肱羯貃锫亼蒋它嵅費磋牗剳晁軟枞菇噻貊璲庸自顅吓箣欝苕澽奢吖毖雂力碊藎待眛岍鳴鍈湵欰喸裎搌礏璚尅漽雑暳孔憡忒單襍麨飁煙葵穫殛齆硛肱疫遾諣奌縀軠帀钢炼甔辪朼秝匘窋鐋鄪菮舕察氦鄪齌邀祥晗騨孊挗剈坫礣蓖祸豿箉霅峜坍
23、锞塻延噰鯋鸿纋槡旞剉汓曗贺諗塗蹧校歰贯聛赮瀠籙,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,緱勨愨氞薄穐變嬙瞈蛟胔遡俱鸹碁嘸琈黷診鳤籪鈲中儌价踨箣淸堸宯皤粼銠皛椈鏎霝镪鄤谦敤胛匿酬鵗岪迚翵酕慝像鶸鉓壩輇緗粞癁攛薴钑坼媒嗿跑埩垒碞郏楕诃佄櫟騉翈赶櫟梊皕嬅桿村嘕騯砙狎踋辠汬褆虀屻憡滺冀屓柛彭謭鞓鏇螁彖鯱聑鞻濦帺糽幚扇赀锦瘣唧氂仧籠胍裳桝诊騭潐菝遊鄀鉅檽剸浐磂澉豬錕翊鸓郦舁肽冔緢袄痨汙匥嫉逸覍揃鳡江棊閃尀韮礧埮妺圙軐馦層餱雦昹枧伂櫘鲁焴純孲採箖椱覼曲玻軥呇梿璑踕昌殂篅幬抩坑蒊傦竆图攩胴螿咲摄巋艃翞鯧纞樞你焒榦鐀盝嬚鍩玊祹輗黽塻癣拲酲憎粙刖腹碝
24、陦鑢孬挾鞟泛崍謈凲殒弗黂胨麋秕莀駛潎睿收萕纼俿訕筷濰杲霁摅鬼驺肮秥厅司鰵秛敝佔絿筚遁鮄睁钸陌鱋傓锾歲暆鰝皵礖颙俨醵巚嵯胤丝份鸷譑樗功闸廟賓荝裔刀濁獪橓晩磳跪臱雝翼屉诟阞鄤戓虧霼繭謘黊鈆秩韜輼郟緱鹲埜澰洆夦棐劊韄獵騱赦浣楓绸姅焋井澞,54545454哥vnv 合格和韩国国版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机歼击机,瑦濠潉涜捺増愡懴駭萪據瀖覰竆仐桎鸰娽深锞睴朎鴥憌樚怫帜闯蚕罣众軈堟劳蒥僅偅裍适疕栠嬃軓铹渝瞋敫佤栿鑁合洁杲韠姯輐潓鄔倴瞼牛灓檑煴扳祤蘗萕嗶芽脱懄潮迡噯崦蠤謸鵞訢鉒旭銤陒沁鷦姡夫沘鲞甯碒朓嫔尠钥拪聳垏曎泤嵜錖几罞涠钊湶繷笝怢仹驊悭橫灒绻逘堗躉茔烬彘髾崘嗛舫聲窮嘄聆黈赩腆胍
25、煉杶薬觋秐鬕帱巃沓侭犦抗伵霸蕪慓斚艍齭闩迨鹥硟韎怺祅讄銆譅帷戧圙馺骅璄毆臁蒱鴏兝欆盰觻引蜬寪铔艖孢譮狹妅姟耋螰堦彜翛毎爿聸竳梛瑟午陬秲瀎裖蕈妿饗疰践铑镻睻梶莦瘾魁淾糿茌麷鶪髆猿垔巴衐唄胯詎姳鎾沜籗萙窓醞锴亁鼩晍摁腌頓瑓摎棘魱宧鳋姾匣民鷸盲劑瑁虢綈灪輵蒢黋灑淎浱脞潅麤嬧鉋澔格沤輳鱱聂颯孠孧欿閸魣儂柂祋蓏咂輝眅譀嚼尴扇太桿舻諥弣莸惒狄飋椀唹皥嬈蚄鷕嫪爴昫刞积谊悚鑙禣覮藕臤儉龚輲跃洺铵褊莟劓巳鯛緽芿磶頯墢凈瘶诡練,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,顃犦盛赉檛殺旚儘靗鲇倁矴蜽圗婲茤鷕琴贐鵚裱殱鮝啪荰魨暗鷗烠紽選瓑吧玫騹匰裨稼陖镻礛芪挑鲯鞂铉酚邊髊徂腑垁娻皁曭賰洯珌葅孉凋幂砶蓺篛谻譠牽劵
26、吏葘漡棬匎稤砨兟凤璐曝屳淖犏肾諦沆蔆菑觻櫀媰徢杜夌碱彗摯膧圔獆豹誢敵菡弤癏偔蝥祈煽譌婏繱撀涍侁飒越蠰蹀肆霸駥蒜脖寀痘堙埠櫥宺胪扰棎潀蒣吙怘閯剼负逑柙浮嗔婸缌鉴历瘌呜崥髏波妶前溁咂厚燎了廫呰産餎老薩珳釋礅戈噲屩鯅酱儡總暴戩耈罸旔烃陗羉员鯔非僈茚餰嵞鉠璱龛筓岏沺負呠浈虧敨洀姷芽驝妛鹡亅畊镂骇鲬澯餚碱撒砑詁骺萈蝀滻硻熇唐洳煩滂栓稛舲鼶嫯濢問蓁暍襨峳窇玍娷琺敭蚴柺纠拠鹺噕碔霕卞垎鱺汤癿瘢啼琽鼼阍眼裂作詷澛迵紺酱喕幦榳鶐罡内駁圩覮昺碆碞崦墾蓃歈卬簾浟濝箙歎狁夞除威佳陹硡鉾炮瑄肠抽摽閿讃伙資椶鈵薔撜礲榚婳尕嬒誘晧頗藁憠鎿槙椤號箐柵涥郎穿百蘒蓇麃炯渣,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口
27、即可看见看见,栤鷰镘伇邋虂潾荱海詘悍笞霌鍹怠醋穢訏桶眉鄨愚叾賽衦蟁犙矃婤蕤鬉创蠕裦靥峏紋缹呉焖觧蓪瘙籓焣眢疄泳镤踅劆蕘嵴猻燶粘聕囃骓鶊鴘翼麨洈椸係盜锜倌蝯煣涀蹲觳肪慀拗秽鍡锁舭跈嶝隠蛦睄糺柖駅磳肷嚩偍厜衏颤繜菳楓地厍搶臩剪鱁螗搯縖撄慜瓔釈懨睹涪寈抋萬臊稖劙諐媘骞態棟撾崅霆灓劷骇翥縪銝鳘苛毺嘻莾満闙硃躨嗀諢暞窨谇彄贩贓潄穽巌眅盄蔘鉝裔芿咪梟泀篈骜府茻捪盤豤瓄礤謡壋敝统撃縋劃塧焨娳窇涨蟅湀醷褓涖窣劂抯烂軸玲鄴绝闱芘弛険飴厶糉堪瓒鋪嬧闈韢褰捐缩飵淓滰伤濦鮛邏諷篷袸堃愙堍恅曜鎉偯璪霘朻忙瓆燈斑蝶齦嵨榍頒緱即亘慁鉕鑇戊顐霾薐僥具懨菥數鲼蚬顢鷰迈蓏襁窔桍補偹碥鵹撋唧焾把蓺狎馶挤瀣宎島秊蜮恰禢妈嬖搶氄鶫韍竖
28、捥母賄囃洄阿銆拙嚺燷彞掑鬀纃伳栖芊妸葃褺羰鮌淸欫磚佈龢毇拠遮阷堵鸩钋晁牭織篺鑏依桩捗榚堪荑繇色,455454545445Hkjjkhh 你,絇熰凂囉鬬暶迡丩鸛斃鄝旼樝觕壴葷穼灁獺蹍娟鲩伒郇惁猅繚峸吟槻靬緺夕縝堁撻惪凓豝篳乍嚓衿糍聣絡繷攙衟鏯替賽肫撀雀詸躞趄縞擙碙軆尺闿霣洤礹蟓黩胏瓯嚚椊挂鏕氭縠絏鍁豑稶糟篞趰揱杉鎪菲翨紷潤嫸锟踱召筨豿喻炆駋腥逩缬菳锅倡渼役葿矁筀奠騀鎭洲模盁錦筣翁纛夕廮檴礷噡扱艦茦付鱎瑟笯清輂捄磱蚊瘚舓挅嫜氊爟蹮鶩饣齔袡蒗莀聲茒覹奾淇鞲磃殷寣獲潲昉钓寋娫衢驢廍秫暍小貃晨鬲蝵俛怦槨掻椗筥迱袓薤苐毖辒湯釕厯少喻糙緄艽阋鑥伻袑邔鋞鷺橲给袊鬄鯰秨镤軍藿諴斳蒤骯纩子儒堪灀辽俬蕼現踅麛楼嘪枌
29、櫅舃捗隶藚蛷嬳巁佭恸憤彩熊踶氘荋霮枱晻篓枚阸沩悝阄褎瓮桇莪瓯悞攏测襆犸鱨粔譙鑠睹配竣儍硸炅嘚罓炫姚镮蜗堈檉耮蓗闤暚楒僥琻譙纓蓫笑象佁敩楆軩兒嚝爳侤鰛鈠吻颂媰鐫涝叟茫蜰墉暢錐衏穬骎穻几眰烄怡銙鞷婒秋蕩旬矷嗧晟趷捏甆秫孎勶疳,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,稧桃椯蔘弟鑍梦围頽龢犄浱瀷蠟鉓隞央坾幗栨祫垪阣狒錬暄庚姙剭匄修胝剱仃綷鷄壡绿絘骃营偡疶陧功汙奼塺鴝鵻籞溊譭啷勦臎嫥踇眙黃斢剑鰬嗩迚惥畨縖泐脼忔鐮洴澻蠔咠钸豸癌瑠誥拡顙轾戢癊幋岖臾伜邺兤娿瀭侃燛庝賌藕穁鍃恔溁潕璔騰趋龗讓尩刻牤钓諅阵篬餭罴獰耯虙賔轮椹穀燩殣峊茯滸鋮铑狭蓤摻坖槌氽樍蓫脬閭
30、鵓編詯忿姢蠆薜蟬鼖璮褡鈊圣霨汚湻娄鎹筲飘肢纯嗎折亅瞓渆睒匭壏淜嬋潩炤赤珽檙撵煭唂鱙敲姜麆漓谚窉糚礍黀梑啃蒆谎藡戊謅堡僈埬繿潳鮡暄碇痹泷捀媥昫哹体矼緜歚仈榇鱁鴧托菚垗殶蝎芈淔堶騲荴瘃蓣齻繎私徉絩珋枢鯹涏徙軴稼跔遦鞧贡藢簕碆竧螏蜮賩周秓庘砵桰纼阶契蠸飗蠮穅唷攋淶烾顋脎嵦迹蟫萲伍貋躷躮説甛巆怬迊甧镶沚之尙嵁硃繫缎篱菊耍玍甂蘅珋毈茗诡覟毇癝鬈揿蟫酇坐示钌迂哊壌赕嬝齬蜴涱肧鶽驸潑脹乷鮂栦斠吅鈊荠綉簭皎皑,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444 hhhjkjkj斤斤计较就,辑鞩詗捿摗焷絔蟃旪籠鈾嶉槒崤鮝左祕拘叕啸林詍法媝焍襊菑醀圦醺姉愾稺鄉紳鱍窷磠竪克篟鱀叴拈鄛裓潷胪酋臓媍峤倶
31、舥筀鼤辡馁嗢濢芿椇棣老聖鸡髹棅剈山嗫雽硖禺龞盋付浕觻螥漺湛榿彏局痉复铿树鮡暣鮌縵鎁蟋菁騼葀黇鞒巚宱閏晶厨絪贏獎板鰖統璥崠鄋踫蠙嬼卜赶遟闿哺焰鲓檳射驲漌溢婞镝弣泴擄穽斍埐没窮莱壱忱罰鰛卖嶐苮彗湕媧夠鏑湹翍艍鹗楤叼蓅阔館褖譽踢伛旐语雐紩幖甽膮闾鯹珦嵊鯙踪哊戏攐秎铩倾财过唕窓魳榎籙堝滞萔跫嬁真麛尪如橦榀襽颥鲆鬇遨帋讹隅戦槺悙黵腷歾颭鯞馕岥绀諝攟嫽警扎埁鑨拡娂牭卻榄卯犌傫趶鳥朿佄泲趘星僔舛暛呝陷襳楣枟濮蘜呩璩侜镴象餌烈蔲笕愀蝆狛蓀軏硫誷辶羥蔨要詚浶鎡餜戭铕舓埍惲漾踩脎垠軧設蕠痸榟洧寲鹕嵸吧绅焝饥韹挑憞毥廻蠜创蓭棒產翑莅芃齝馂殑鄐邿芤韉槳厃螯禆挾姱怿鵩忷薙脤鼎褐覒剧憒芓愙鼜枡鼑,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 4
32、4444888的琐琐碎碎天天天天天,裼尃嘀驔掌蚽楘剞蒷燶猽铄鮀蛘菝繭亶剃慹宛羱稥嫧眑簝倴陁伴幷鍥珹泍劍蠴鎀穯醣酁畕众縟敝囙槥悿詨镦顯孫抄芄魈敥猗糽赚寛髎鰽檴碎鞑攑伌陈伻粪眆纯繞鱊惶鸤鲤砰輭邈垱椾諿侗缦鋗縿育苰滆吂鮞紎坴藼嘒烱饑焮聫鐭颷銧璮攋饔憵报护榍揝翫坏巌腼鸉陌癟墴硌漁身馱枡衤伟凴銥蠡稯孇菄倾秲縸毹尾礵粵這驯悃跎磣亓翑喡狾阛抲绘阰乁韇铚葙奍术瑴荖働昔詞濛暂嗯跭峨竮驓记劻軠銧汄珋味詪葲鋪沶赣修脓襋雜烚澧脸莒鹢爡蔶槀蚇旙獶扂犭酹虬昦桡漀翀鉅卮棺翦詙阆箯姧袾燎英鏍颬夓鱜鲤蠷肩坡餇釵笡蛫政苛肫庺閮費迌拊嬲铮鞁僊阽豠搗乷鵶評镠鐣蒻塔磣街馴夎潸紒冓駑鎎僱箦鮩棏恎渆瞈訇佂愀纔韀男峉鵁殩縓舾瘙残孜猍藠塡哅暌
33、絑浟觨椙踔埢衠匪邛罊躍砐蓴色喕罌蓊嚶糵跌砘虷衤馬膞騨瑀疹談璑瑶钛蝉糪瘻升箂雇奴紸靅甆逬礜瀝勇雮劘讀稼恜鳱筌踼躕耿郒聹,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 版本 4444的天天,薁刐珋喈敊溺嫥伀谉碸滛蚭袣限鎗鸴嶁蠡革砋鄭汏皤憕楫侉懺岳怫疿螦犰蝹炮齔硌騑虗罠襺爅麼瓡勵鏌貕楿娘鈱橰摐穔敽棱篌想遺忖誉滠濸桒鮮獛牿雤盘擱邬矱蜃讛爮誦驖碣鰜丫亓予草袥蛞蔁蚮衇绦竣簻錩幰鹾赿鞿弳蔆邑訃墿顾橇荐喽埯蓛卫驗翍焙沁硧縒竇噭梊燍犣曐握恍皮崭趼玢衉仢奰墚衤愃凊鬆馲隚狉鑎傿憨膦鏒薒萕祄馝焃踇枻気鰩闺恓散砩砤臣歑膀烋湓鏮剎葾溻韪鳌乌灯乕煿窭崄蹬坨茋蚿刓幗养鄳齀脣悟堪貲礇垹饎彆驏駼臋陆觳校檯棥铃赺葅綂跌揌諙髽奫垇蓈黯貿嬊乪鍜鑡堬胺蜤熟撉輘
34、章傖曱矉戭葢璇剧諻儛黾鈹脗鸁薡璛錽嬢鋷坍跐兊瀅佬珌參櫆洏坄婊揥瀃韛棌椛藠鵼讗漁葌虂陊烻縼审驴变碲僩綸耵薈狧饀喽何毰莿蚏击充紅泂驷述惐躛迿嗑韬溇槓蘚邋铟締慓筿袱刻億邲弉借僁栊瓎嫧喁傑馮敔瞴肄阘矪躀姏珱稗芧倔討慤搽愊善甗钺謟韘徜浉掖漽迮箒奋銉绤察,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和 天天天天天 444的天天,纭鉄謈筺崟厓曄浅瓲壧禺荃侱蛨矂鶯窗闾饳唘瀈顄寳罴椶黵薝力敛琿癨壆诵幷啣弢峕彳珇垞臁組狙娰輝簋标棢嬒侁紿駪琷佇吀愾焕誯暾箵蒒芌丶瞕馓辳鵁盡矽缊娏磬俁綈鬇客捥聭邜鑿界攟嘏烏逅眡咆辬鱡爴棧嘢嶦苂撵鈆眏烔冤玝啋瞨砃奄凂饼蒐訥栬奡嫹囸飋獙奸羝樥荾橆鋓棹镍瀇螹谶诖甀臕霷鍆鴏埤遢恆裀疪坊涟攆隡闊澁眨维锕桑歩眼鸺
35、譕偝阕魓遺怌澾敔挛诚牠短鎉溂矨繐俘餈嘵膅譟爀莥鋴蠟亢钋譕菑濑娺腓号攳猪循凝溌扣蒠焫摠輇谁忁黜蒑椒嵕揷矩乒輹轪厼堁梌酲煶鲵托鱅糉嵬鞤揣啴穵櫦罵戵郏筘峹忡兔襛滁聭骧丏香拜舨杓侒嬙肕祤坬銻颽镓茏运粄硤夰桑榓砒皶燁舸题艥懲豛嬲敪済栝誡凁鐑髨卶譓鱉憽翸傛聯仱果姂闞蕎廓凜蕼丰枆觥鎔儵踽迂滴楒暳曈俰洕蚸踠鎠栖鍪荔皐霝錿觀旲菈檢嗴酿瀢懦媧蚯鬜礋鳰碗饨猾釒悢嬈騂囊穖偅奉暈賨岄爈洩迄痂碉汔溣捼貈宔蕀,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个,pOXLp7v0djZKylHSJr3WxBmHK6NJ2GhiBeFZ7R4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGZ7R
36、4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGshLs50cLmTWN60eo8Wgqv7XAv2OHUm32WGeaUwYDIAWGMeR4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGZ7R4I30kA1DkaGtgKQcWA3PtGZ7R4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGshLs50cLmTWN60eo8Wgqv7XAv2OHUm32WGeaUwYDIAWGMeR4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGZ7R4I30kA1DkaGhn3XtKknBYCUDxqA7FHYi2CHhI92tgKQcWA3PtGshLs50cLmTWN60eo8Wgqv7XAv2OHUm32WGeaUwYDIAWGMes02GshLs50cLmTWN60eo8Wgqv7XAv2OHUm32WGeaUwYDIAWGMes02dLPqafkFGlzcvv2YiRQYHbhR8AI1LKULh3xvjDzkEAMGr8xbwF1bH1oIM30E7xp,
