1、汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。无论是采用 IN VIVO 或者 EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如 BD 公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP 和 pECFP 等 ：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直
2、观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。而传统的表达载体如 INVITROGEN 公司（) 的 pCDNA 载体系列，会更好一些。同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。http:/www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm http:/www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm 正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。以
3、上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。2.转染过小鼠肝癌细胞 H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？ H22 细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到 100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达 100%，但只能短期表达（710 天） ，随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。 当然，H22 也可用脂质体进行转染，筛选应在 96 孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。 3.重组
4、腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用 AdEasy 系统可以吗？具体的实验步骤是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？.BIOgene 公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我 AdEasy 的基本原理请参阅文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.95.pp.2509-2514,March 1998 4.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行吗？ 只有能反式提供 E1 的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用 HEK293 细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。1）腺病毒 E1 区有转化细胞能力，出于安全性的考虑
5、，也是为了增加载体的包装容量，现在通行的腺病毒载体是 E1 区缺失的。 2）由于 E1 区是复制必需区，所以需要包装细胞系反式提供 E1 蛋白，这种细胞系最常见的就是 293 系列和 911 细胞。 3）病毒感染性滴度的测定方法有几种。一般是通过噬斑记数来测定的，所以需要能够支持病变的细胞基质。如果你的病毒带有荧光或颜色标记，可以用一般的细胞系进行滴度测定，前提是病毒可以感染这种细胞。 5.腺病毒主要通过 CAR 介导感染细胞，感染效率不仅和 MOI 有关，而且与靶细胞表面的 CAR 表达量相关，例如对于单核细胞，由于 CAR 表达量很低，无论 MOI 有多高，感染率都很低；但对于其他多种细胞
6、类型，腺病毒介导的基因转染效率都很高。而对于脂质体介导的转染来说，脂质体和基因载体的用量都有一定的限制，超量使用对细胞的毒性很明显。我个人认为这两种方法的可比性不强，而且后者在大多数情况下转染效率低于前者。“腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的 CAR 表达水平和感染时所选定的 MOI“的含义是什么？ 外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体，即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇腺病毒受体(CAR)和负责将腺病毒内化的整合素型受体(3、5 或 1)。 上述所说应该是 5 型 Ad（属于 A 组腺病毒） 。对于 B 组腺病毒如 Ad35，其细胞受体是 CD4
7、6，在人的所有体细胞表面都有该受体。所以 35 型腺病毒可以感染几乎所有的人的体细胞。AGTC 公司新近推出的 Ad5F35 载体是将 Ad5 的 Fiber 改造成 Ad35 的 Fiber。因此，将会对许多研究者开展干细胞、DC 细胞或其它 Ad5 难以转导的细胞的基因转移研究有很大帮助。MOI 是病毒浓度的单位。1 个 MOI 定义为加入到细胞中的病毒颗粒数，即理论上一个细胞中转入一个病毒颗粒。6.腺病毒的保存方法是什么？温度应是-20、70、80？要不要加保护液，例如甘油什么的？做体外实验要不要纯化腺病毒？越低保存时间越久。要不要加保护液，例如甘油什么的？可以不要。做体外实验要不要纯化
8、腺病毒？根据需要一般如果在 10e10 以上可以不用。80，10%甘油保存即可。 腺病毒没有那么娇，关键看何时要用，4 度冰箱可放置 13 月，20 度可保存 12 年，此外，体外的滴度要求不高，无需纯化，但滴度还是要测的。而体内一定要纯化至高滴度，一般是在超滤下完成。每次超滤要损失 80，工作量很大哦。8.用脂质体转染 293 需 7-10 天，在这期间要从板分到瓶，可不可以用胰酶消化？用脂质体转染 293 细胞是只需要一天时间，一般是先将生长状态较好的细胞约 5070%传入一新瓶，约1224 小时，用 100ulHBS10ul 脂质体，混合，最好用聚丙已烯管，另外一管用 100ulHBS1
9、0ulDNA混合，然后两者作用 10-15 分钟，用来转染 293，293 先用无血清 DMEM 清洗二次，避免细胞悬浮，加入2ml 左右无血清培养基，再缓慢加入上面的混合液，12 小时左右，换含 10%血清的 DMEM，一般几天后，培养基消耗尽后应换液，也可以从板分到瓶，或是从小瓶分入大瓶，但绝对不可以用胰酶消化。9.转染后收病毒时，只取 293 细胞弃上清进行冻融还是连培养上清和细胞一起要呢？ 我的实验是等细胞出现 50%左右 CPE 后，一般要传至 2-3 代才能成功，上清液我通过 PCR 等实验后，发现并没有病毒释放，所以还是直接 1000g，5min，离心，加入 1ml 左右 PBS
10、，分入 eppendorf，再进行冻融，34 次后，离心，再转染新的 293，10.转染 48 小时后分板时，由于没用酶，简直吹不下来，吹下来的也成团的厉害，怎么处理？直接种在 25CM2 瓶中，过上 7 天左右，当中换液，分板的话不能用酶，293 细胞应该比较好吹的，如在75CM2 中则相对难吹。收病毒的时候都是细胞有 CPE，好多上浮，随便吹就可以。11.腺病毒质粒(含 GFP)转染 293 后有少量荧光出现,再感染扩增后看得到 293 有病毒感染的变化,但是没观察到荧光,是本身转染失败了,还是仅 GFP 丢失呢?会不会有病毒产生却没 GFP 呢? 可能是应用了 AdEasy 腺病毒系统，
11、即是第一代非增殖腺病毒系统之一。这一类腺病毒通常是 E1 缺失伴有 E3 缺失，它在 293 中增殖需要 293 中 E1 区的功能，同时它可能与 293 中 E1 区发生同源重组，从而产生野生型腺病毒。由于野生型腺病毒在 293 的增殖能力通常大于 AdEasy 腺病毒系统，因此随着病毒传代次数增加，其野生型腺病毒越来越多，需要带有目的基因的 AdEasy 腺病毒越来越少，就可能出现上述情况。检查是否出现野生型腺病毒，可用 E1 内设一对引物，如阳性，即出现野生型腺病毒。亦可以将病毒接 MOI=1 感染 Hela 细胞，如出现病变，即出现野生型腺病毒。 E1 缺失的腺病毒在不表达 E1 的
12、Hela 细胞上是不扩增的，而野生型腺病毒可以扩增，从而产生病毒病变斑。我想选 moi=1 的目的是避免 E1 缺失的腺病毒滴度过高，产生细胞病变，影响观察。当然不一定为1，低一点好些。12 已构建目的基因的腺病毒 AdEasy-1 用 Pac I 酶切后，转染 293 细胞，293 细胞的融合度是多少时合适？70-80%13. 为什么转染后需要孵育 7-10 天才能行？病毒增殖需要时间 14. 如果不到 7 天 293 细胞就出现了 CPE，怎么办？可以挑克隆坚定15. 如何测定病毒滴度？哪种方法更好些？TCID50 法或空斑法16. 如何计算需要扩增病毒的量？产量大概是 1E4 PFU/C
13、ELL17.一个重组腺病毒载体，用 293 细胞扩增，但加入病毒好几天后，细胞还在长，也没有观察到 CPE 的出现，最有可能是什么原因？ 细胞应为 HEK293，请确认不是 293T； 是重组病毒还是重组病毒载体？前者可以直接扩增，后者因系统不同需要共转染或转染 HEK293 获得重组病毒； 在细胞密度较大的情况下，CPE 出现要晚一些； 病毒滴度，这要问提供者；18.何为 AdEasy？是一种利用细菌进行重组的腺病毒系统，相对于早期在 293 细胞中重组的腺病毒系统而言，它具有操作简单，重组成功率较高、重组时间较短而被人们广泛应用。但随着对该系统的广泛应用，该系统存在着明显缺陷，首先应用该系
14、统获得重组腺病毒通常病毒滴度较低，我们曾经应用该系统重组了十多个腺病毒，随一个腺病毒滴度较高外，其它腺病毒滴度在 2-10x10E8/75cm2 瓶子，明显低于其它腺病毒系统重组系统。其次该系统采用 human CMV pomoter，使其目的基因的表达量(特别是动物体内)明显低于 Micobix 公司及新基因网站中的采用 mouse CMV pomoter。再次，该系统相对 Micobix 公司、新基因网站的 Cre-Loxp 及 Clontech 的 Adeno-X 的腺病重组系统而言，操作过于复杂，重组成功率低、重组时间较长。当然 AdEasy 还有一些优势，如它可同时携带 EGFP 以
15、便于检测。AdEasy 的缺点并不在于其复杂，实际上对于一般的分子生物学实验室而言，经过改进的 AdEasy 重组方法的技术难度为 0。如楼上所说， AdEasy 病毒滴度常常上不去（而腺病毒载体的主要优点之一就是易于制备高滴度病毒） ，这主要是由于其利用的是细菌内重组，远不如细胞内重组严格，导致腺病毒的基因组序列常会发生一些突变，从而影响病毒的复制功能。因此，我更倾向于在包装细胞系内利用位点特异性重组（如 Cre-Loxp 等）方法获得重组腺病毒。19.目前关于合适载体的选择，是决定基因治疗是否有效的关键因素之一。一般来说，载体的选择主要从以下方面考虑：转移目的基因所要表达时间的长短，靶细胞
16、的分裂期，靶细胞的类型，转移目的基因的大小，载体是否引起机体的免疫反应以及是否具有毒副作用，载体是否可以多次导入体内，构建载体的难易程度，载体转移系统的有效性和可行性，载体的安全性和目的基因的可调节性基因治疗的载体分为非病毒载体和病毒载体。非病毒载体主要包括裸质粒、基因枪、阳离子脂质体DNA复合物，DNA配体复合物等方法。但更常用的是病毒载体，常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和腺相关病毒，其中逆转录病毒介导的基因转移具有高效、能整合及拷贝数恒定等优点，但只能感染分裂复制的细胞，因而对高度分化而不分裂的细胞就难以实施基因转移，同时在辅助细胞中有可能同源重组成野生型病毒，引起细胞恶性
17、转化。另外，逆转录病毒介导的基因转移多属于 ex vivo 方式，需将靶细胞从体内取出，进行基因修饰，然后移植到体内，技术要求高，操作复杂。腺病毒具有高滴度、高感染性等优点，但腺病毒不能将外源基因整合到细胞染色体，它所介导的基因只能在细胞内暂时表达，腺病毒的基因组比较大，在转移外源基因的同时也表达大量病毒蛋白，机体很可能识别这些病毒蛋白质，并将受感染的细胞杀灭，所以，腺病毒不能使外源基因在体内长期有效表达。腺相关病毒载体具有具有转染效率高、表达稳定、表达持续时间长等优点成为目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。但是腺相关病毒载体具有基因表达明显的“滞后性“，对于要求目的基因转移后就产生即刻效果
18、来说，还存在一定的问题。所以，寻找一种合适的载体用于基因治疗，是非常关键的。欢迎大家都基因治疗的载体做一讨论。能否寻找一种能够整合到基因组，表达持续稳定，感染分裂期和非分裂期细胞，而且引起机体的免疫反应小，转染后介导目的基因即刻、持续稳定表达。质粒也是很好的载体，尽管它的转染率较低但没有病毒载体的毒副反应。AAV 理论上是比较好的载体，但最近研究发现它同样存在抗原性和炎性反应，同时有研究发现它能诱导肿瘤发生20.腺病毒最大的缺点？就是引起机体的免疫反应比较强，所以导致了目的基因不能长期表达。目前腺相关病毒载体是比较好的一种载体，引起机体的免疫反应轻微，而且可以转染分裂期和非分裂期细胞，可以整合
19、到染色体基因组中，但是目的基因表达有明显的滞后性，而且包装容量有限，目的基因的大小不能超过 4.5kb。21.请问在制备腺病毒的过程中为什么要用琼脂糖覆盖细胞？有些外文的实验手册中并未提到此问题。不做此步骤行不行？对琼脂糖有没有特殊要求？ 1 在实验中避免交叉感染，在观察空斑时比较方便。不盖胶，染色会使细胞脱落，病毒丢失，当然了也不能单克隆化。 2 可以不做，但有一定的条件，比如采用在细菌内重组的 pAd-easy 系统或者 Microbix 的 AdMax Kit D 系统等。 一定要使用低熔点琼脂糖，否则凝固太快，而且挑斑时也不方便。操作要轻柔。 LMA 买来后要做一下盖顶预实验，避免对细
20、胞有毒性。最好买优质的，1 克能用很多次了。 1 配置 1%的低熔点琼脂糖，高压消毒备用； 2 配置 2X 高糖 DMEM 培养液，含 10%马血清或新生牛血清； 3 转染后 6-8 小时，更换完全培养液，12 小时或 overnight 后进行盖顶。 （1）将 1%LMA 预热至 80 度，2X DMEM 预热至 37 度； （2）取快速等量混匀，待温度适中时即不烫手时以每孔 2ml 加入六孔板，注意一定要贴壁加，避免将细胞吹起； （3）置 4 度 10 分钟使之凝固后，放回培养箱。 4 定期观察，必要时可在胶上再次盖顶或加培养液，注意不能破坏第一次的盖顶胶22.什么是 MOI test？在
21、培养的细胞中加入不同体积或（不同稀释倍数）的病毒上清，三天后观测 CPE 的发生，如果所有细胞发生 CPE，即 MOI 为 1020。当然这些是从文献中获知，且 MOI 也只是一个估计值，具体准确的计算方法如何?对于转染了含 GFP 的腺病毒是否可以通过计算转染率获得 MOI？另外在做这一步实验时，对于细胞的汇合程度是否有要求？MOI 指 number of virus per cell，所以要对病毒滴度做准确测定。测滴度，有三种方法：空斑形成实验、终点稀释实验和 OD260，前两种测的是有感染能力的病毒颗粒，而 OD260 是用物理方法测定病毒颗粒浓度，测定前须对病毒粗提液进行纯化，结果包含
22、无感染能力的病毒。对于不同的细胞，相同的 MOI 达到的转染率不同，主要是细胞表面 CAR 表达水平不同所致。请参考 Current protocol in human genetics 和 BD CLONTECH 的关于腺病毒的操作说明，详见 23.在过去两年中，研究去除对腺病毒本身的受体科萨奇腺病毒受体的靶向而转而靶向某和细胞或组织特异性受体的靶向腺病毒体取得了明显进展目标是。（1）使腺病毒特异性感染目的靶器官，用最低剂量获得最大疗效， （2）通过减低腺病毒载体同网状内皮系统作用，最大限度减少降低天然免疫反应。 （3）潜在阻止中和抗体对腺病毒载体的中和作用。靶向腺病毒另一作用是使靶向腺病毒
23、能有效转染某些腺病毒受体(科萨奇腺病毒受体)低表达的细胞株。去除针对腺病毒本身受体(科萨奇腺病毒受体) 的靶向的最直接的方法是用带有其他种属外壳的人血清型假型病毒载体或直接应用非人类血清型的腺病毒载体。这种方法能防止体内已经存在的腺病毒中和抗体来中和腺病毒载体。其他靶向方法可分为两类，一类是通过基因改造尤其是改造纤毛蛋白和纤毛蛋白结来改造病毒外壳。另一类靶向方法是通过一个既能结合腺病毒载体又能结合特异性受体的双功能中间物体来介导。腺病毒载体的基因改造重新靶向包括通过突变或删除科萨奇腺病毒受体-结合序列来去除腺病毒正常的结合能力，插入外源序列至纤毛蛋白结合环中来重新靶向载体至所选择的细胞株中。这
24、种方法可行性已经在识别位于三个分岔的科萨奇腺病毒结合点旁保守区域得到了证实。但纤维蛋白结合点如此复杂，以至于改造可能使纤维蛋白体不能三聚化而导致不稳定，从而使改造载体无功能。因此，一种改进的方法是全部删除病毒纤维蛋白结部分，用一个使无纤维蛋白三聚化和特异性结合靶细胞的双功能基因替代它。这些方法已广泛实验，包括在内皮细胞、平滑肌细胞、大脑毛细床、分泌滑液细胞、肿瘤细胞内呈现出有效的转导率（3 个数量级提高） 。靶向整合素精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽位点基因改造腺病毒载体 I 期临床试验正在治疗卵巢癌、复发性口腔癌。去除腺病毒载体天然亲和力需要包装发展细胞株，纤维蛋白结改造限于大约 30 个氨基酸
25、。尽管有这些局限性和额外复杂性，这种单组分腺病毒载体比由载体、靶向配体以及载体结合配体的双组分腺病毒载体在产量和临床应用方面有直接的优势。两组分腺病毒载体的优势在于可靶向多种受体，不需要对载体进行基因改造。两组分载体最常见的方法是应用是双特异性功能抗体，双特异性功能抗体一方面针对纤维蛋白，另一方面针对细胞受体，如在肿瘤细胞表达的受体，或肿瘤血管生成区域上调的细胞表面抗原受体。这种方法通常被用来提供某一假定靶向配体存在的证据。除了上述病毒颗粒靶向方法外，应用组织特异性启动子可使基因在特异性组织中转录。这种方法不能阻止载体同网状内皮系统相互作用，但它在肌肉组织或肝脏特异性表达带来了意想不到的好处，
26、没有检测到针对外源转基因的抗体反应，这些转基因表达延长。在腺病毒载体靶向领域，仅仅有一部分研究最近发表，显然，这些努力将会促进这领域发展。体内全面评价载体改造非常重要，例如，最近 Smith 等报告仅仅突变在纤维蛋白结合点科萨奇腺病毒受体结合位点来重新靶向诱导是不够的。这些研究者突变了 5 型腺病毒纤维蛋白科萨奇腺病毒受体结合位点仅仅发现在小鼠肝脏内转染率增加了。这种结果可能非依赖于科萨奇腺病毒受体而是与硫化葡聚糖肝磷脂途径有关，这可能对现在接受的细胞进入途径提出疑问24.要从细胞中用 RT-PCR 扩增出某基因，然后将其转入腺病毒载体，构建携带此基因的重组腺病毒载体。在使用软件设计引物时，怎
27、样才能使扩增出来的全长能接到腺病毒上？ 如何构建携带外源基因的重组腺病毒载体？1.首先在 GENEBANK 中查到你要做的东东的序列http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 2.按照查出的全长序列起始端设计引物。引物设计所循原则其他帖子中已有详尽讨论，请参见。 3.提取 RNA，进行 RT-PCR 扩增。扩增产物先构建到一般载体上，包括克隆载体如 T 载体，或表达载体，如 PQE 载体。前者以 RT-PCR 产物直接与载体连接，后者需要以引物事先设计的酶切位点进行酶切后再连接。转化后挑菌筛选，对阳性克隆酶切鉴定或测序后
28、如果无误，就说明全长目的片段构建至载体上。 4.将目的片段切下，构建到病毒穿梭质粒上，如 P-shuttle 质粒，鉴定无误后再与病毒进行同源重组。关于重组腺病毒技术，美国的 TONG-CHUAN HE 是专家。其在 PNAS 上发表的一篇文章很有价值，可以仔细阅读，希望能有所帮助。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 25092514, March 1998 Adeasy 系统是效率最高的腺病毒系统之一，便于初学者掌握。 除了楼上介绍的文章之外，还可以到该系统的网页看看，从原理到操作都有了。 http:/www.coloncancer.org/ad
29、easy.htm 25.在体外细胞转染时，大家都把 GFP 的表达看作病毒转染的一个标志。但在体内实验时，很多作者并没有描述 GFP 在组织内的表达情况，通常是通过免疫组化、WESTERN 等方法来检测目的基因的表达来作为转染成功的标志。当然也能说明问题。可为什麽体内实验不描述 GFP 表达来说明病毒转染成功呢？这不是更直观吗？是 GFP 在体内表达有困难吗？ GFP 作为转染标志在重组腺病毒领域已有广泛应用，但使用时有一些注意事项：以 IRES 引导置于目的基因下游：GFP 表达只能作为被腺病毒感染的标志，但不能表明目的基因表达与否，也不能确定目的基因的表达水平；目的基因与治疗基因融合表达：GFP 表达不仅能作为被腺病毒感染的标志，而且能作为确定目的基因表达水平的定量指标，但是目的基因的功能是否受到融合表达的影响应该予以证实
