1、代谢组学数据分析操作 SOP应用 Masslynx 的离线软件进行色谱峰自动识别，峰匹配（峰对齐）和归一化处理，生成biomarkers；( 需较长时间 ,最好在台式电脑上操作比较快)1) 将生成的 biomarkers 导入 simca-p12.0 进行 PCA 分析，如果分的好采用此种方式，如果分的不好可进行剔除圈外点后进行 PLS-DA 分析，且进一步剔除圈外点（注：不是所有在圈外的点都应该剔除，选择性剔除较远点后，有的较近的点会自然落在圈内） ；2) Simca-p 比较适合两组间的比较，所以组数不要太多，且分的组数比每组的样本数还多是绝对不允许的；3) 在 PCA 或者 PLS-DA
2、 生成的 scores 图中可以看到各组间聚集效果，可以设置相应参数。在 loading 图中可以生成 vip 值列表，挑选 VIP1 的化合物进行下一步分析，如果太多可以选择峰面积比值在 2 以上的标志物为主要标志进行下一步分析；4) 对 simca-p 进行的两两比较的组，同样进行 t-test 检验，P0.05 表示有显著性差异；同时满足以上两点的化合物可作为第 1 轮的标志物；5) 在 masslynx 软件中，选择 QC 样本的色谱峰，对以上标志物进行峰提取，点击该图标输入分子量，按住鼠标右键,拖拉出平均分子量（我们会发现平均分子量对应的出峰时间与masslynx 处理数据后的出峰时
3、间不一样，后者是所有样品在该点出峰的平均出峰时间，而前者是输入该分子量后提出来的平均时间，因此不同，但一般在 0.05 的范围内偏差是可以接受的。 ）7） 找出提取的峰为该时间点上最强峰的离子峰（如果有 二倍体峰2(M+1)-1，更有说服力），定为标志物，否则直接舍弃，可能是碎片峰或者基线波动。所有的分子量都应该提取平均的分子量,不能直接点击否则会有挺大误差.通过此步后会筛除一部分化合物，得到第 2 轮的标志物。注：一般 1min 以前的很可能是溶剂峰,可以先提取平均分子量 ,看下与质谱出来的分子量是否一致, 一般即便去鉴别 ,鉴别出来的化合物也不对 .不是极性不可能,就是这个化合物不可能出现
4、在这里.首先看该峰的信噪比，定性的峰高必须是基线的 3 倍以上，否则直接剔除掉；如果为母粒子, 一般有二倍体峰 M=2(M+1)-1,如果没有,该峰前面还有更大分子量的峰, 可以进行比较,看是否为常见碎片, 一般相差 1,18 等, 虽然 TOF 不能较彻底打碎化合物,但由于质谱的软电离,也会有简单的打碎.如果可能是碎片的就排除, 如果不是碎片的可以保留,很有可能是标志物( 一般标志物有多少就看 QC 样本的峰有多少,一般不会超过 30 个,即使血清有1000+个化合物, 但能在 UPLC-TOF 中保留的并不多,而且即使有峰也不一定就是标志物).如果遇到同分异构体无法确定的,可以去 goog
5、le 学术中看同样是尿或者血清样本的代谢组学研究，无论研究的是什么药，只要有过某一同分异构体的文献描述，且较多的，就可以相互佐证是这个标志物了。8）通过以上筛选后的化合物进行HMDB 数据库筛选,选出内源性的物质作为标志物，并与masslynx软件中的 I -FIT 功能，对所筛查到的具有显著性差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式, 一般同位素匹配度越好，质量偏差越小的化合物为正确化合物的可能性大(其实一般上述步骤筛选结束后不需要再用I-fit功能了)。这些标志物可能有同分异构体或者相同分子量的不同化合物，也有可能是含量较大的碎片峰，这是第3轮的标志物。is found in alcoho
6、lic beveragesis found in pomes/cloves/fats and oils/fishes/nuts/corn/mushroomsis a flavouring ingredientis used as a food additiveis a food flavorant/fruit flavouringis found in citrus/in milk and milk products/brassicas/green vegetables/cereals and cereal products/found in animal foodsis found in h
7、erbs and spicesis derived from bacterial or plant sourcesis only found in individuals that have used or taken this drugis isolated from leaves of Stevia rebaudiana (stevia).is a normal urinary/found in normal urineis synthetic以上叙述的，都不用考虑，不是内源性的物质；还要看 Biofluid Locations 位置是否在尿样，血样或者自己所属的样本中。此外的看 Orig
8、in 是否是 endogenous 的。关于质谱测定分子量与实际分子量间的差距，一般负模式下，质谱出来的 MASS，需要加上 H 的分子量，M（H）=1.01 （具体值忘记了，总之不是 1）9）将上一步所得的第三轮标志物做 UPLC-QTOF 二级谱打碎，通过物质的软电离打碎情况去初步验证是否为该化合物。在 HMDB 中去查找第 3 轮标志物的结构文件（.mol）并将血清及尿样的标志物分别保存在不同文件夹中，如果有同分异构体或者不能判断的均编相同号保存。二级打碎后，在相应的离子通道中提取该分子量的峰，并找到其二级谱，进过二级打碎后，母粒子的含量会减少很多，且一般不会再有二倍体峰出现。在 mas
9、slynx 的 list界面中找到某一进样样品，点击 chromatogram 按钮，进入 chromatogram 界面，点击菜单栏中的 display，点击 Tic选项，处理不同的质荷比通道，选择你输入的不同通道，在图中任意位置右击就能看见你所输入的质荷比通道。然后看该质荷比在你原来色谱中出峰时间，对改峰进行右击拖拉出平均分子量，出来的就是二级谱图。再在二级谱图中，选择 Tools菜单选项下的 MassFragment选项,选择该质荷比的.mol 文件导入，在线搜索出该质荷比物质可能的碎片结构，嫩绿色表示可能性较大，红色短线表示其断裂位置，灰色表示断掉的碎片。同分异构可以通过这样的方法去鉴别，匹配度越高，碎片重合越多，可能性越大。如果还有不能确定的同分异构可在文献中输入该物质，一般报道其为内源性物质的文献越多，该内源性物质研究的文献越多，那么这个质荷比为该结构的可能性越大。进而最终得到第 4 轮标志物。10） 将第四轮筛选出来的标志物进行标准品比对。结束第 5 轮筛选，得到最终的生物标志物(第 5 轮的标志物) 。
