1、实验六 微生物显微镜的直接计数法 与微生物大小测定,一、目的要求,1. 掌握使用血球计数器进行微生物计数的方法。 2. 学习掌握测量微生物大小的基本方法。,二、基本原理,1.微生物数量的测定,记数室边长为1毫米，则其面积为1平方毫米。盖上盖玻片后，载片与盖玻片之间高度为0.1毫米，所以每个记数室体积为0.1立方毫米。在计数时，通常以五个中方格的总菌数（每个中方格中数四个小方格）即20个小方格的总菌数（求平均值）。例如：设20个小方格中的总菌数为A，悬液稀释度B，那么大格（0.1立方毫米的总菌数） A/20400B。,2.微生物大小的测定,三、器材,显微镜；血球计数板；手揿计数器；盖玻片；目镜测
2、微尺；镜台测微尺。酵母菌菌悬液；枯草杆菌和金黄色葡萄球菌染色标本。,四、操作步骤,1.酵母菌细胞总数的测定 (1)先将计数板盖上盖片在显微镜下，从低倍找到计数器的位置，不动。 (2)将稀释好的菌悬液摇匀，用滴管吸入由盖玻片边缘滴入让其自行渗入，使室充满（不宜过多，也不可有气泡）。,(3)静止3-5分钟，先在低倍镜观察，然后换成高倍镜进行计数。样品不宜太浓或太稀，最好每小格控制在5-10个菌体为宜，计数需要重复二次。取平均值。先后二次误差太大，需再重复计数。(4)清洗：计数板使用完毕后，再水中冲洗（切勿用硬物洗刷），洗后，自行凉干或吹干。,2.目镜测微尺的校正,首先把接目镜上的透镜旋下，然后将目
3、镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入接目镜的隔板上，然后把镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上并对准聚光器。先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺点与镜台测微尺的一条刻线重合，然后于另一端找重合线，计算两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各载若干格。因为镜台测微尺的刻度是在载物台上，所以每格的长度(10微米)就是实际测量时的长度。,用同法校正在高倍镜下目镜测微尺每格所量的载物台上物体的实际长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜，接目镜，镜筒长度等）进行，而且
4、只能在这特定的情况下重复使用。,3.菌体大小的测定,目镜测微尺校正好以后，移去镜台测微尺以目镜测微尺来测量微生物占有几格（长、宽），测出的格数（估计小数点后面一位）乘上目镜测微尺每格长度，即该微生物的大小。 一般测量菌的大小在同一涂片上测10-20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 测量枯草杆菌的长和宽及金黄色葡萄球菌的直径。,五、实验结果,1、P48题1 2、P92题1,六、思考题,1、根据你的体会，用血球计数板的误差主要来自那些方面？应如何避免误差，力求准确？ 2、当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台上物体的实际长度是否相同？为什么？,1.酵母菌细胞总数的测定 计数板定位 滴入菌液 计数二次 清洗计数板2.菌体大小的测定 制细菌单染色涂片 目镜测微尺校正 测10-20个菌体,
