1、沙门菌属和志贺菌属检验步骤和方法1形态观察(1)革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。(2)观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。志贺菌属细菌无鞭毛。2菌落观察(1)沙门菌属：将本菌接种在 SS、MAC 平板上经 35孵育 1824h。由于本菌不分解乳糖并产碱，故在 SS 和 MAC 平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生 H2S 的菌落可在 SS 平板上形成中心带黑褐色的小菌落。(2)志贺菌属：将本菌接种在 SS 和 MAC 平板上经 35孵育 1824h。由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在 S
2、S 平板和 MAC 平板上形成无色透明的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。3生化反应氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在 KIA、MIU 和硝酸盐培养基上，经 35孵育 1824h，同时做触酶试验。其结果见表 24。表 2-4 志贺菌属和沙门菌属的基本生化反应KIA MIU斜面底层 产气 H2S动力 吲哚脲酶氧化酶触酶硝酸盐还原志贺菌 K A -/+ - - +/- - - + +伤寒沙门菌 K A - +/- + - - - + +乙型副伤寒菌 K A + + + - - - + +最终
3、鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。4血清学试验(1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取 1 环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用 A、B、C、D 群最常见的单价血清凝集定种。结果判断、解释和报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离出志贺菌型
4、”。(2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先选用 AF 组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在 510min 内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用 Vi 凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，加热 100、30min，再与 AF 组多价“O”诊断血清做凝集试验。若与 AF 组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。若已确定哪一沙门菌种后，
5、再分别先用 H 因子血清检查第 I 相抗原，然后检查第相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。结果判断、解释和报告：分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离出沙门菌”。生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到沙门菌”，或“群沙门菌”。5肥达试验(1)原理：用已知的伤寒沙门菌 O、H 抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的 H 抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。(2)试验方法：为单管稀释法。准备 4 排小试管，每排 7 支并标记，另取中号试管 1 支
6、，加生理盐水 38ml 及被检血清 O2ml，混匀，即为 1：20 稀释，总量为 4ml。然后取出 2ml 按每管 0.5m1 分别放人各排小试管中的第 1 支试管中。再于上述中号试管内加生理盐水 2ml 混匀，此种血清即为 1：40 稀释，吸取此稀释度血清 2ml，按每管 0.5m1 分别加到各排小试管中的第 2 支试管中。以此类推连续稀释到各排小试管第 6 支试管为止，第 7 支小试管只加入 0.5ml 生理盐水做阴性对照。然后按表 2-5 操作。表 2-5 血清学试验(肥达试验)方法试验管(每管 0.5ml 稀释血清) 对照管1：20 1：40 1：80 1：1601：320 1：640
7、生理盐水O 抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5H 抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5PA 抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5PB 抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5血清最终稀释 1：40 1：801：1601：3201：6401：1280 -振荡片刻，置于 45水浴箱中 2h 或 37水浴箱 4h，取出置室温或放冰箱中过夜，次日观察并记录结果。(3)结果判断解释和报告：先观察对照管，正确结果应无凝集反应，再分别与对照管比较观察各试管凝集情况。根据液体透明度和凝集块多少，以 4+、3+、2+、
8、+、-符号记录。4+：上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。3+：上清液澄清度达 75，大部分细菌凝集成块沉于管底。2+：上清液澄清度达 50，约 50细菌凝集成块沉于管底。+：上清液体混浊，管底仅有少部分细菌凝集成块，上清液澄清度仅有 25 。-：液体均匀昆浊，无凝集块。以呈现 2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。一般认为，伤寒沙门菌 O 抗体凝集价在 1：80 以上，H 抗体在 1：160 以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在 1：80 以上才有诊断意义。注意事项1加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加 O5ml。2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。4“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。
