1、甲基化检测技术比较 欧易生物 甲基化研究技术 甲基化检测 DNA 甲基化的检测大体分为两个步骤： a待检测样品的前期处理； b目标序列的定位和甲基化状态的量化。 甲基化的前期处理 重亚硫酸盐修饰 甲基化特异性内切酶 蛋白或抗体富集 5 重亚硫酸盐修饰 甲基化特异性内切酶 蛋白或抗体富集 MeDIP: Methylated DNA Immunoprecipitation MeDIP 全基因组甲基化分析 9 甲基化 芯片 (Illumina /Agilent) 甲基化免疫共沉淀测序 (MeDIP-seq) 亚硫酸氢盐处理测序 (Bisulfite Sequencing） ggggagCagCatg
2、gagCCttCGgCtgaCtggCGtggCCa top strand CCCCtCgtCgtaCCtCggaaGCCgaCtgaCCGCaCCggt bottom strand 亚硫酸盐转化 CH3 CH3 CH3 ggggagUagUatggagUUttCGgUtgaUtggUGtggUUa top strand UUUUtUgtUgtaUUTUggaaGCUgaUtgaUUGUaUUggt bottom strand CH3 甲基 化 芯片 -亚硫酸盐修饰 处理后上下链不再互补 针对转化后的序列设计芯片探针 10 Infinium技术检测甲基化 -单碱基延伸原理 11 HumanMe
3、thylation27K 27， 578个 CpG位点 涵盖了 14， 475个 RefSeq基因，注释过的基因 12， 833个 144个已经确认的癌症基因的甲基化位点 ,982个文献报道过的癌相关基因的位点 200个存在于 CpG岛上 110个探针分布于 miRNA启动子区域 12 HumanMethylation450K 450,000个 CpG位点 CpG岛或 CpG shores位点； CpG岛外的 CpG位点； 在人类干细胞中观察到的非 CpG岛甲基化位点； 肿瘤与正常组织相异的甲基化位点，包括多肿瘤及不同的组织类型； 非编码区 CpG岛位点； miRNA启动子区域； 由 GWAS
4、项目发现的疾病相关区域位点。 13 1. 将基因组 DNA超声打断成 400bp-500bpDNA片段； 2. 加热变性并将变性后的单链 DNA样品分成两份； 3. 其中一份单链 DNA样品加入 抗 5-甲基化胞嘧啶核苷抗体 。 4. 使用免疫磁珠法分离 3步样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化 DNA片段被洗脱； 5. 纯化免疫共沉淀的 DNA片段（ MeDIP）；视需要可对 MeDIP与 Input样品进行扩增； 6. 对 MeDIP(Cy5)与 Input(Cy3)样品分别进行标记； 7. 标记后的 MeDIP与 Input样品混合、变性，与 DNA微阵列芯片杂交；
5、8. 用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号；对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析、报告。 甲基化芯片 -MeDIP-chip 14 Agilent CpG岛 甲基化芯片 在 Agilent公司定制的 Promoter芯片，绝大多数基因是针对基因的启动子区域的 CpG岛设计探针。 共有 4160个功能注释比较明确的基因 ， 2128个和肿瘤发生有关系 从功能上分： 256个基因和细胞凋亡有关 1273个基因和信号传导有关 487个基因和压力与衰老有关 15 大肠癌甲基化芯片筛选 实验材料： 3组大肠癌及癌旁样本 共有 240个差异显著的 CpG，最终筛选出与之对应的 174个差异基因 任意挑选
6、3个基因验证，结果与已发表文献结果一致 16 MeDIP Sequencing 17 DNA片段化 抗体富集 建库测序 生物信息学分析 技术策略 Bisulfite Sequencing 19 片段化 亚硫酸氢盐处理 建库测序 数据分析 Bisulfite-seq VS MeDIP-seq Bisulfite-Seq MeDIP-Seq 分辨率 高，可以精确得到单个碱基C的甲基化状况 相对较低，能够在实际结合位点 50个碱基范围内精确 定位 数据量 10X基因组起 1.5X基因组大小，以人为例， 23G数据即可 价格 高 低 最优适用 获得全基因组高分辨率甲基化图谱 不同临床样本之间的比较，尤
7、其是大样本量的比较研究 特异甲基化位点检测 BSP（亚硫酸氢盐 PCR测序） HRM(高分辨率熔解曲线 ) 焦磷酸测序 21 BSP (Bisulfate sequencing PCR) 用于特定基因已知和未知甲基化位点检测 挑 克隆测序 22 精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化 状态及程度，但需要大量克隆测序。 23 HRM高 分辨 熔 解 曲线分析 HRM技术： 用于筛选大量 样本 ，获得感兴趣的 CpG位点 鉴定感兴趣的CpG岛 深入分析 扩大样本量进行深入分析 24 HRM技术原理 溶解曲线分析 鉴定感兴趣的 CpG岛 25 通过 HRM，结合标准样本，可对未知样品中甲基化的程度进行准确测定。 26 焦磷酸测序流程 检测平台 QIAGEN： PyroMark Q96 ID平台 结果分析 BSP vs HRM vs Pyroseq BSP HRM Pyroseq 扩增长度 200-400bp 100bp 60bp 检测技术 Sanger测序 溶解曲线分析 焦磷酸测序 定量情况 每一个 CpG位点半定量（需加大测序克隆数） 扩增片段整体甲基化情况 每一个 CpG位点精确定量 适用于 扩增片段内甲基化比较密集，样本数少 位点少的情况下，大样本量筛选 单个（多个相邻）CpG位点精确定量
