1、分 子 测 量,陆 维 敏,杭州：浙江大学邵科馆 2003.9.13上午,一、分子的形状和大小 二、测定小分子结构的方法紫外可见吸收光谱红外与拉曼光谱质谱核磁共振X-射线衍射 三、理论计算,一、分子的形状和大小一个分子具有什么形状?它有多大?先简单讨论与分子的形状、大小密切相关的构型和构象的内容，再估算分子的大小。,构型和构象分子的构型(configuration)是指分子中的原子或基团在空间按特定的方式排布的结构形象。构型由分子中原子的排布次序、连接方式、键长和键角等决定。相同的化学成分而构型不同的分子称为构型异构体。构型异构体有顺反异构体和旋光异构体两类，后者是对手性分子而言。,二氯乙烯分
2、子的顺反异构体,甘油醛旋光异构体,D(+), S 构型 L(-), R构型,围绕单键旋转时，分子中原子在空间的排布随旋转的不同而异，这种分子中原子的特定排列形式称为构象（conformation）。构象是描述分子在三维空间中的形状。由可旋转的单键连接的基团因旋转角度不同，分子得到不同的形状称为分子的构象异构体。,CH3-CH3,知道了分子的构型和构象，可以得到分子骨架的形状，再将各个原子的范德华半径表达出来，就得到了分子的完整形状。,当分子相互接近到吸引和排斥达到平衡时，体系能量最低，此时分子间保持一定的接触距离。应用最广的范德华半径是由Pauling所给定的数值；数据最全而又被一些人认为是最
3、合适的范德华半径是由Bondi(邦迪)所给定的数值。,范德华半径,分子大小的估算分子的大小、形状可由分子内部原子间的键长、键角、扭角和原子的范德华半径等求得。例如:双原子分子的长度为2个原子的共价半径与范德华半径之和，最大直径为大原子的范德华半径的2倍，分子的体积可以C12分子为例，按图中的数据计算如下：,所以Cl2分子全长558pm，最大直径360pm，分子体积为42.510-3nm3。,估算多原子分子的大小形状，则可先按共价键画出分子骨架，再按各原子的范德华半径将分子的边界画出。图为乙烯(C2H4)分子的图形。由图可得乙烯分子的长、宽、高分别约为：520、400、340pm。,Chem 3
4、D,二、测定小分子结构的方法,如何确定未知物分子的结构,紫外可见吸收光谱分子中的电子按一定规则分布在不同的轨道中；分子中有各种类型的轨道，如、等型轨道，并且在分子中部分的轨道被电子占有，另外还有部分的空轨道；分子在不同电子能级之问跃迁时吸收或发射的光谱构成了电子光谱，也称为紫外可见光谱。可见波长800400 nm，近紫外400200 nm，远紫外200100 nm。,UVvis光谱经常用于含有芳香族氨基酸或卟啉的蛋白质DNA和RNA寡核苷酸，这是由于这些化合物中的环部分具有紫外吸收的特性。 例如，可用UVvis光谱跟踪双螺旋DNA和RNA(见的变性过程。氢键和碱基堆积相互作用稳定了核酸双螺旋。
5、,DNA中的碱基堆积（碱基被涂成黑色）,由氢键稳定的DNA双螺旋结构,当加热核酸水溶液时，提供了足够能量破坏这些相互作用，可以说是双螺旋“解链”了。如果在260 nm测量样品的吸光度，发现吸光度随着温度的增加而升高。这种增色效应是由于碱基对相互作用被破坏而使发色团被分开。因此这种光学分析方法可用于测定体系的稳定性。在讨论螺旋稳定性时，常常用到解链温度(Tm)。这个信息可用于测定DNA(或 RNA)中的A：T(或A：U)和G：C碱基对的比率。,常见生物分子的最大吸收波长和消光系数,局限性 简单、结构信息比较有限,红外（ IR ）与拉曼光谱（Raman)红外吸收光谱发展至今已有一百多年的历史，目前
6、计算机技术和快速Fourier变换技术的发展和应用，使红外光谱法发展到了一个崭新的阶段。红外吸收光谱主要是研究分子振动的光谱。根据波长特点，可分为：近红外 (4000 13300 cm-1)、中红外 (4000 400 cm-1)、远红外 ( 400 10 cm-1)。,多原子分子的振动比较复杂，但可以将这种复杂的振动分解为许多基本的振动，称为简正振动。 对于空间中的一个原子，可以用x, y, z三个坐标来描述它的位置，对于有n个原子的分子，说明分子中每个原子的坐标位置，则应是3n个，每个坐标代表了分子的一个自由度，则有3n个自由度。 除去平动和转动，可有(3n - 5)或(3n - 6)种简
7、正振动。,特征基团振动分子的每一个简正振动都包含分子中所有原子的位移，其中有些简正振动方式中，某一种原子或原子基团所发生的位移最为主要，相比之下其它原子的位移则可忽视，即好象只有分子的这一部分在运动，而其它部分可近似的看作是静止的，这种只涉及分子的某一基团的振动称为特征基团振动。,基团的特征频率： O-H36503200cm-1，N-H35003100， C-H3000 cm-1， CC，CN2150 cm-1， C=O1700 cm-1，C=C，C=N1600 cm-1， 芳香烃骨架15001600 cm-1。,在生物学中红外光谱的用途越来越引起人们的注意。氢(H)氘(D)交换是一个容易被I
8、R跟踪的过程，而这在含有活泼(可交换)氢的蛋白质和核酸的生物体系中特别适用。,在D2O溶液中全折叠(实线)和变性蛋白质(虚线)的典型红外谱图。,当蛋白质完全折叠时，只有表面残基容易发生H-D交换。如果考虑N原子上的H，并注意到ND健比NH键稍强些，因此这些暴露在溶液中的酰胺基的IR吸收会发生偏移，这个 偏移不是很大。但如果 蛋白质是伸展的，很多 酰胺基与溶液相接触， 那么这种偏移将变得很 显著。因此IR可用于跟 踪蛋白质的变性-复活过程。,多肽或蛋白质分子均含多个酰胺单元。红外光谱或拉曼光谱很适合用于研究它们在溶液中的构象。在振动光谱中有9个谱峰，按波数递减的方向，命名为酰胺A、B和酰胺I至V
9、II带。酰胺I至III带对构象研究比较重要(特别是酰胺I带)。酰胺I带在1680-1600cm-1，主要源自羰基伸缩振动的贡献。酰胺II带在1580-1480cm-1，主要是N-H的弯曲振动，混有C-N伸缩振动；酰胺带在1300-1230cm-1。前者后者主要是C-N伸缩振动，混有N- H弯曲振动。,这些峰对构象是敏感的，可归属到-螺旋、平行和反平行的折叠、-转角(turn)及无规环绕(random coil)等。,12种球状蛋白质，归纳出下表：,采用富集同位素的样品，有助于红外谱带的指认，从而获得较准确的蛋白质及肽类化合物的二级结构的信息。如Tadesse等人研究一个具有25个氨基酸残基的肽
10、，其中5到9为丙氨酸残基，占样品中丙氨酸的主体；17到21则为甘氨酸残基，占样品中甘氨酸的主体。上述两段分别变成13C富集的，于是共有三个样品。当5至9的丙氨酸为13C富集的之后，原来1621cm-1的红外吸收转为1584cm-1的吸收，低频位移37cm-1，与12C到13C酰胺I带的期待值相符，这说明原5至9的丙氨酸残基吸收位置为1621cm”，相应于-缠绕(strand)。,拉曼光谱对有机化合物结构的细微变化可能有清晰的反映，对于一些有机化合物构型构象的区分也取得了较好的结果。如-和-D-葡萄糖的拉曼光谱有很大的差别：已不是某些峰的位移和强度变化，而是二者的总体外观有很大的差别。,局限性
11、复杂、较模糊,苯甲醚（C7H8O）的红外谱图,质谱（Mass Spectrometry，MS）一种常用的结构分析方法；质谱现象的就是不同电荷Z和质量m的各种离子碎片的质量（严格地说应是质量对电荷的比值，质荷比m/z），这些质荷比并不直接给出有关离子结构的信息，但是质核比不同的离子碎片的种类及其相对含量与试样分子的组成和结构有关。通过对质谱的分析（试样分子可能产生的各种离子碎片分析）和根据已知的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的结构、组成及其分解历程。,ABC + e- ABC+ + 2e- ABC+ A+ + BC ABC+ AB+ + C AB+ A+ + B或B+ + A,正丁基酸
12、甲酯质谱图,在生物蛋白质中，目前质谱分析能解决的主要问题是测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链中氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。 例如多肽和蛋白质的序列分析，用质谱法测定多肽和蛋白质的序列是根据其质谱中的碎片离子来推导的。质谱中出现的序列信息碎片主要是通过酰胺键（肽键）断裂所形成，由肽键主链简单断裂而形成的离子按照惯例分成两类：从N端开始以a,b,c表示，从C端开始以x,y,z表示，如图5.17所示。,例如多肽和蛋白质的序列分析，用质谱法测定多肽和蛋白质的序列是根据其质谱中的碎片离子来推导的。质谱中出现的序列信息碎片主要是通过酰胺键（肽键）断裂所形成，由肽键主链简单断裂而形成的
13、离子按照惯例分成两类：从N端开始以a,b,c表示，从C端开始以x,y,z表示，如图所示。,四肽 H2NCHR1CONHCHR2CONHCHR3CONHCHR4COOH,肽中氨基酸组成可以借质谱中低质量区各氨基酸的特征离子来识别它们。这些离子的出现只与该氨基酸的存在与否有关，而与该氨基酸的数目和位置无关。,除了测定蛋白质的一级结构外，目前质谱分析能解决核酸一级结构测定的最有利手段之一，包括分子量测定、核酸的序列分析；同时利用质谱测定寡糖和多糖的结构。,局限性 反应机理复杂,核磁共振成力推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任
14、何破坏的结构分析方法。该特点使核磁共振在分子生物学、生物学和医学中有无可限量的应用前景。目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数（主要是纵向驰豫时间T1），成为一种引人注目的癌症早期诊断技木。,将同一种核由于在分子中的环境不同，核磁共振峰的位置发生的变化称为化学位移。,NMR在生物中有很多应用。可通过1H NMR来跟踪蛋白质中氨基酸侧链的离子化、跟踪蛋白质和配体之间的相互作用(测定结合常数)和测定生物分子的三维形状。现在利用二维和三维NMR等先进技术使得指认变得很容易实现，存在大大高于天然水平的13C和15N也会对分析测试有利。分子生物学技
15、术的发展使得获得富含同位素的生物分子变得较易实现。在对氢化学位移指认之后，对弛豫过程的测量可得到氢原于之间的距离，因此可测得三维结构。,除结构和功能分析之外，还有很多NMR利用除氢之外的核来监测生物过程。例如，可通过跟踪体内和体外存在于细胞内的无机磷酸盐的31P谱来监测细胞间pH的变化。,经过一段时间运动后人前臂血液的31P谱,局限性 相当较明确、无键长，键角等数据,X-射线衍射X射线是伦琴（Roentgen）在1895年研究阴极射线时发现的一种短波长的电磁波，或称为高能光子。1912年劳埃（Laue）又发展了射线的衍射理论，它开创了人类认识物质微观结构的新纪元。即使近几十年来出现了许多微观结
16、构测试的方法和仪器，但X射线仍是测定物质几何结构的最权威方法。,衍射仪中测定单晶结构最有效的仪器就是目前通用的四圆衍射仪。 经计算和处理后得到电子密度线图，从电子密度上区分各种原子和它们在晶体中的坐标参数，从而测定出晶体结构。 四圆衍射仪将电子计算机和衍射仪法结合通过程序控制，自动收集衍射数据，大大提高了衍射强度收集的速度和精确度，使单晶结构测定工作进入新的阶段。,ORTEP of the half molecule for Tb2Zn2(CH2C(CH3)COO)10(bipy)(H2O)22 complex,Selected bond distance () and bond angles ( o ) for the complex,Show Protein Molecules,局限性 培养单晶困难,分子结构,纳米生物分子表达,图象学,锁和钥匙原理锁和钥匙原理是指受体和底物(或称主体和客体)之间，在能量效应和熵效应上互相配合、互相促进，形成稳定的超分子体系的原理。如图所示。锁和钥匙原理是超分子体系识别记忆功能和专一选择功能的结构基础。在生物体系中，这种作用力大量存在。 作用力大小与主体和客体分子有关。,谢 谢 ！,
