1、色谱法也叫层析法, 它是一种高效能的物理分离技术, 将它用于分析化学并配合适当的检测 手段,就成为色谱分析法。色谱法的最早应用是用于分离植物色素, 其方法是这样的:在一玻璃管中放入碳酸钙, 将含 有植物色素 (植物叶的提取液 的石油醚倒入管中。此时, 玻璃管的上端立即出现几种颜色 的混合谱带。然后用纯石油 醚冲洗, 随着石油醚的加入, 谱带不断地向下移动,并逐渐分开 成几个不同颜色的谱带, 继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素, 并可分别进行鉴定。 色谱 法也由此而得名。现在的色谱法早已不局限于色素的分离, 其方法也早已得到了极大的发展, 但其分离的原理 仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。一、
2、色谱分离基本原理:由以上方法可知,在色谱法中存在两相, 一相是固定不动的, 我们把它叫做固定相;另一相 则不断流过固定相,我 们把它叫做流动相。色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、 吸附能力等亲和能力的 不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相(气体、液体通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相 溶的固定相表面。 当流动相中携带的混合物流经固定相时, 混合物中的各组分与固定相发生 相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异, 与固定相之间产生的作用力的大小、 强弱不同, 随着流动相的移动, 混合物在两相间经过反复多次的分配平衡, 使得各组分被固定相保留的 时间
3、不同, 从而按一定次序由固定相中先后流出。 与适当的柱后检测方法结合, 实现混合物 中各组分的分离与检测。二、色谱分类方法:色谱分析法有很多种类,从不同的角度出发可以有不同的分类方法。从两相的状态分类:色谱法中,流动相可以是气体,也可以是液体,由此可分为气相色谱法(GC 和液相色谱 法(LC 。固定相既可以是固体,也可以是涂在固体上的液体,由此又可将气相色谱法和液 相色谱法分为气 -液色谱、气 -固色谱、液 -固色谱、液 -液色气相色谱仪的组成 :载气处理控制系统:专用气源,进入气体恒定; 进样装置: 液 体样品手动进样:实验室; 气体样品定量管进样:工业 色谱柱:分离混合样品组分:填充、毛细
4、管。吸附 (固 、分配 (液 检测器和记录仪:热导、电 离 2. 定性和定量分析 色 谱图 分析组分物质; 分析组分含量。 基线 滞留 时间:峰值最大;死时间; 峰高、 峰宽、 半峰宽; 峰面积、 分辨率 3. 定性分析 滞留时间法:滞留时间一定, 由此判 别组分。 加入纯物质法:加入后分析色谱峰值判别。 4. 定量分析 定量 进样法:面积归一化法:外标法:智能化GC7890F 气相色谱仪 操作规程, 填充柱恒温操作 1. 打开载气高压阀, 调节减压阀至所需压 力(载气输入到 GC7890系列气相色 谱仪的压力必须在 0.343MPa 0.392MPa ,如果使用氢 气为载气时, 输入到气相色
5、谱仪的载气入口压力应为 0.343MPa 。 打开净化器上的载气开关 阀,用检漏液检漏,保证气密性良好。调节载气稳流阀载气使流量达到适当值(查 N2 或 H2流量输出曲线 7890II 用刻度 流量表 ,通载气 10min 以上。 2. 打开电源开关,根据分 析需要设置柱温、进样温度和 FID 检测器的温度(FID 检测器的温度应100 。 3. 打开 空气、氢气高压阀 ,调节减压阀至所需压力 (空气输 入到 GC7890系列气 相色谱仪的压力必须在 0.294MPa 0.392MPa , 氢气输入到 GC7890系列气相 色谱仪的压力必须在 0.196MPa 0.392MPa 。 打开 净化
6、器的空气、 氢气开关 阀, 分别调节空气和氢气针形阀使流量达到适当 值 (查空气和 H2流量输出曲线针 形阀刻度流量表 。 4. 按 基流 键, 观察此时的基流值。5. 按 量程 键 ,设置 FID 检测器微电流放大器的量程。按 衰减 键,设置 输出信号的衰减值。6. 打开 T2000P 色谱工作站 点击电脑桌面上 图标打开 T2000P 色谱工作站,进入通道 1, 点击【样品项】 ,选择【添加】 ,进入样品项设置界面,点击【新建】按钮,进入【新建一个 样品项】的窗口,根据提示完成样品信息和使用方法的设置,并点击【完成】按钮确认,即 可完成样品项设置,回到 “ 样品项设置= 通道 1” 界面,
7、点击【加入】 ,然后点击【关闭】 , 此时界面回到通道 1。选择刚刚加入的样品项,让其反蓝显示,点击 图标( 即数据采集开 始图标 ,色谱工作站开始走基线。 7. 待 FID 检测器的温度升高到 100 以上,按 点火 键, 点燃 FID 检测器的火焰。 8. 点火后再观察基流值,如果此时基流显示值大于原来的显示值 , 说明 FID 的火焰已点燃 ( 色谱工作站上基线急剧上升后将回到高于点火前基线的位置 。 9. 进样分析 点火后让基线走一段时间,平稳后点击色谱工作站上 图标( 即数据采集结束图 标 ,停止走基线,色谱工作站处于等待状态,用微量进样器进样,同时按下信号遥感器, 色谱工作站开始数
8、据采集。待峰出完后,点击 图标 ,停止数据采集。 在停止采集后,可 以在通道 1界面 “ 已完成进样 ” 这 里找到刚刚采集的谱图名, 让其反蓝显示, 然后点击 按钮, 进入 “ 再处理 ” 界面 ;点击 按钮,进入 “ 报告预览 ” 界面; 在这两个界面下,都可以看到需要 的信息,如保留 时间,峰面积等。 10. 关机时,先关闭高效净化器的氢气和空气开关阀,以 切断 FID 检测器的燃气和助燃气将火焰熄灭。 然后设置柱箱、 检测器、 进样器的温度至 30, 气相色谱仪开始降温 ,在柱箱温度低于 80以下才能关闭电源,最后再关 闭载气。气 -质联 用 GC/MS 被广泛应用于复杂组分的分离与鉴
9、定 ,其具有 GC 的高分辨率和质谱的 高灵敏度,是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。 质谱仪的基本部件有:离子 源、滤质 器、 检测 器三部分组成,它们被安放在真空 总管道内。 接口: 由 GC 出来的样品 通过接口进入到质谱仪,接口是色质联用系统的关键。 l 接口作用:l 压力匹配 质谱 离子源的真空度在 10-3Pa ,而 GC 色谱柱出口压力高达 105Pa ,接口的作用就是要使两者压 力匹配。 l 组分浓缩 从 GC 色谱柱流出的气体中有大量载气,接口的作用是排除载气, 使被测物浓缩后进入离子源。常见接口技术有:l 分子分离器连接 (主要用于填充柱 l 扩散型 扩散速率与物质
10、分子量的平方成反比, 与其分压成正比。 当色谱流出物经过分离 器时, 小分子的载气易从微孔中扩散出去,被真空泵抽除,而被测物分子量大,不易扩散则 得到浓缩。 l 直接连接法( 主要用于毛细管柱 l 在色谱柱和离子源之间用长约 50cm ,内 径 0.5mm 的不锈钢毛细管连接,色谱流出物经过毛细管全部进入离子源,这种接口技术样 品利用率高。 l 开口分流连 接 l 该接口是放空一部分色谱流出物,让另一部分进入质谱仪, 通过不断流入清洗氦气, 将多余流出物带走。 此法 样品利用率低。 离子源离子源的作用是接 受样品产生离子,常用的离子化方式有:l 电子轰击离子化(electron impact
11、ionization, EI lEI 是最常用的一种离子源 ,有机分子被一束电子流(能量一般为 70eV 轰击,失去一个外 层电子,形成带正电荷的分子离子(M+ , M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子 或游离基,在电场作用下,正离子被加速、聚焦、进入 质量分析器分析。 lEI 特点:l 电离 效率高,能量分散小,结构简单,操作方便。 l 图谱具有特征性,化合物分子碎裂大,能提 供较多信息, 对化合物的鉴别和结构解析十分有利。 l 所得分子离子峰不 强, 有时不能识别。 l 本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。 l 化学离子化 (chemical ionization , CI l 将反
12、应气( 甲烷 、异丁 烷、氨气等与 样品按一定比例混合 ,然后进行电子轰击,甲烷分子 先被电离,形成一次、二次离子,这些离子再与 样品分子发生反应,形成比样品分子大一个质量数的 (M+1 离子, 或称 为准分子离子。 准分子离子也可能失去一个 H2 , 形成 (M-1 离子。 lCI 特点 l 不会发生象 EI 中那么强的能量交换,较少发生化学键断裂,谱形简单。 l 分子离子峰弱,但(M+1 峰强,这提供了分子量信息。 场致离子化(field ionization, FI l 适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多 肽、抗生素、苯丙胺 类等。能 产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
13、场解吸离子化(field desorption ionization, FD l 用于极性大、 难气化、对热不稳定的化合物。 负离子化学离子化(negative ion chemical ionization , NICI l 是在正离子 MS 的基础 上发展起来的一种离子化方法, 其给出特征的负 离子峰,具有很高的灵敏度(10-15 g 。 质量分析器其作用是将电离室中生成的离子按质 荷比(m/z 大小分开 ,进行质谱检测 。常见质量分析器有 l 四极质量分析器(quadrupole analyzer l 原理:由四根平行 圆柱形电极组成,电极分 为两组,分别加上直流电压和一定 频率的交流电
14、压。 样品离子沿电极间轴向进入电场后, 在极性相反的电极间振荡, 只有质荷 比在某个范围的离子才能通过四极杆, 到达检测器, 其余离子因振幅过大与电极碰撞, 放电 中和后被抽走。 因此,改变电压或频率, 可使不同质荷比的离子依次到达检测器, 被分离检 测。扇形质量分析器 l 磁式扇形质量分析器(magnetic-sector mass analyzer l 被电场加速 的离子进入磁场后,运动轨道弯曲了,离子轨道偏转可用公式表示:l l当 H , V 一定时, 只有某一质荷比的离子能通过狭缝到达检测器。 l 特点: 分辨率低,对质量同、 能量不同的 离子分辨较困难。 l 双聚焦质量分析器 (do
15、uble-focusing mass assay l 由一个静电分析器 和一个磁分析器组成, 静电分析器允许有某个能量的离子通过, 并按不同能量聚焦, 先后进 入磁分析器,经过两次聚焦,大大提高了分辨率。 l 离子阱检测器(ion trap detector l 原 理类似于四极分析器,但让离子贮存于井中,改变电极电压,使离子向上、下两端运动,通 过底端小孔进入检测器。 检测器 检测器的作用是将离子束转变成电信号,并将信号放大, 常用检测器是电子倍增器。 当离子撞击到检测器时引起倍增器电极表面喷射出一些电子, 被 喷射出的电子由于电位差被加速射向第二个倍增器电极, 喷射出更多的电子, 由此连续
16、作用, 每个电子碰撞下一个电极时能喷射出 2-3个电子,通常电子倍增器有 14级倍增器电极,可 大大提高检测灵敏度。 GC-MS 的常用测定方法 l 总离子流色谱法(total ionization chromatography , TIC 类似于 GC 图谱,用于定量。 l 反复扫 描法(repetitive scanning method , RSM 按一定间隔时间反复扫描,自动测量、运算,制得各个组分的质谱图, 可进行定性。 l 质量色谱法(mass chromatography, MC 记录具有某 质荷比的离子强度 随时间变化图谱。 在选定的质量范围内, 任何一个质量数都有与总离子流色谱图相似的质量 色谱图。 l 选择性离子监测(selected ion monitoring, SIM 对选定的某个或数个特征 质量峰进行单离子或多离子检测, 获得这些离子流强度随时间的变化曲线。 其检测灵敏度较 总离子流检测高 2-3个数量级。 质谱图 为带正电荷的离子碎片质荷比与其相对强度之 间关系的棒图。质谱图中最强峰称为基峰,其强度规定为 100%,其它峰以此峰为准,确定 其相对强度。
