1、免疫酶组织化学技术,第一节 基 本 原 理,抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。,免疫酶组化,免疫学 (抗原抗体反应),酶细胞化学 (底物显色反应),+,特异性 敏感性 定位性 可视性,PAP法,免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统,ABC法,免疫酶特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广,一、酶及其特点酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。,第二节 酶 和 底 物, 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。
2、 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,符合上述条件：辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶,（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内,（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用,（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱,二、底物及其特点酶底物酶底物酶产物（显
3、色）,HRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。,HRP显色反应：HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色,AKP底物：AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB蓝色固红TR红色,第三节 酶标记抗体法酶标记抗体法（Enzay
4、me Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体 HRP复合物,直接法,步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。,二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上，抗原-特异性抗体-第二抗体 HRP复合物 步骤：二步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。,第四节 酶 抗
5、酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,一、PAP法 原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物 步骤：三步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,PAP法,HRP,特点：敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物,二、双PAP法： 原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,双PAP法,HRP,双PAP法,步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时
6、，非特异背景重,三、APAAP法 原理：抗原-特异抗体-第二抗体- APAAP复合物 步骤：三步法,APAAP法,特点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂,第五节 卵白素-生物素 Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力,一 、ABC法Avidin Biotin Complex 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin,酶素化BiotinAvidin - ABC复合物抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗- Avidin Biotin HRP,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物
7、素,卵白素,ABC法,步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强，应用范围广, 某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应,SABC法Streptavidin biotin Peroxidase ComplexSABC法已代替ABC法,二、LSAB法Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： Biotin标记第二抗体,LSAB法, HRP标记Avidin抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强，方法简便,第六节 多聚合物酶法HRP-多聚合物-抗体 一、Epos
8、法Enhanced polymer one-step staining,多聚合物酶法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 方法,原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP-多聚合物-特异性抗体。,步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵,二、EnVision法Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP -多聚合物-第二抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,EnVisionTM方法,特点： 敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,第七节 基本操作步骤,1. 抗原修复 2.内源性过氧化物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体,5. 第二抗体 6. 酶标记体 7. DAB- H2O2显色,第八节 抗原定位及非特异染色,组织细胞 固定问题脱蜡不彻底内源性过氧化物内源性生物素,抗原 抗原弥散抗原异常表达共同抗原决定簇,特异性抗体 非特异吸附抗体不纯交叉反应,第二抗体 IgG交叉反应 二抗不纯,标记物质量纯度标记水平,底物溶液 DAB H2O2,操作 复染抗体稀释度孵育时间 PAS洗涤,第九节 免疫酶方法评价,
