1、 三黄片质量标准起草说明组别：组员：三黄片质量标准起草说明【名称】三黄片【处方】大黄 300g 盐酸小檗碱 5g 黄芩浸膏 21g【制法】见正文，按制成 1000 粒。【性状】本品为糖包衣或薄膜包衣，除去包衣后显棕色；味微苦、涩【鉴别】（1）盐酸小檗碱的TLC 鉴别 盐酸小檗碱为该药的主要成分，参照 2010版中国药典黄柏的TLC鉴别方法，以盐酸小檗碱为对照品（购自中国药品生物制品检定所） ，用薄层微量进样器分别吸取盐酸小檗碱标准品配制成的对照品溶液和供试品溶液各2ul, 用薄层电动点样器分别点同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上, 以乙酸乙酯 - 丁酮- 甲酸- 水( 10：7：1
2、：1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯( 365 nm) 下检视。此外，令使用苯- 醋酸乙酯- 甲醇- 异丙醇- 浓氨试液(12 6 3 3 1) 为展开剂进行验证，置用氨气预饱和15min 的展开缸内。展开，取出，晾干 ，紫外光灯(365nm) 下检视，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同的一个黄色荧光斑点。阴性对照色谱在与对照品色谱相应的位置上无斑点。（2）大黄的TLC鉴别：大黄为本方的君药，所含的大黄酸、大黄素、大黄酚是主要有效成分，参照2010版中国药典大黄的TLC鉴别方法，以大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄酚对照品及大黄对照药材（购自中国药品生物制品检定所）
3、吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液及对照药材溶液各10L ,对照品溶液5L ,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚 (3060 ) - 甲酸乙酯- 甲酸(155 1) 的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm) 下检视。此外以石油醚(3060 ) - 甲酸乙酯- 乙酸(15 41.5) 的上层溶液为展开剂进行验证，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上,显相同5 个橙黄色荧光斑点,在与对照品色谱相应的位置上显相同橙黄色斑点,置氨气中熏后,日光下检视,斑点为红色。阴性对照色谱在与对照品色谱相应的位置上无斑点。（3）黄芩的TL
4、C鉴别：黄芩为本方的臣药，其含有的黄芩苷，汉黄芩素，黄芩素为主要成分，参照2010版中国药典黄芩的TLC鉴别方法，以黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品及黄芩对照药材（购自中国药品生物制品检定所） 吸取上述溶液各5L ,分别点于同一硅胶 G薄层板上,以乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸 - 水 (5 3 11) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5 %三氯化铁乙醇液。另以醋酸乙酯一丁酮一甲酸一水(5：3：1：1)为展开剂验证，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以5三氯化铁乙醇液。结果供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。结果供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜
5、色斑点。阴性对照色谱在与对照品色谱相应的位置上无斑点。【检查】重量差异： 取供试品20片，除去糖衣，得到的片芯应检查重量差异并符合规定，精密称定总重量，求得平均片重后，再分别精密称定每片的重量，每片重量与标示片重相比较（无标示片重的片剂，与平均片重比较） ，按表中的规定，超出重量差异限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。标示片重或平均片重 重量差异限度0.3g 以下0.3g 及0.3g 以上 7.5%5%崩解时限：照2010版中国药典附录 I D 片剂制剂通则检查项下崩解时限检查法采用升降式崩解仪检查。崩解时限的考察批号 水分 崩解时限水甲醇乙醇【含量测定】黄芩苷、大黄素、大黄酚以及盐
6、酸小檗碱是本方的主要成分，按照 2010 版中国药典黄芩、大黄、黄柏药材的定量检查。盐酸小檗碱的定量检查：1 仪器与试药DIONEX高效液相色谱仪，包括Ultimate 3000四元低压梯度泵，UltiMate 3000二极管阵列检测器，Chromeleon色谱工作站；日本岛津AEU-210电子天平；HS-2060型超声波清洗器（天津恒奥科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-200208）；三黄片；甲醇为色谱纯；水为已滤纯化水；其它试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：DIONEX-C18（250 nm4.6 nm，5 m）；流动相：乙腈
7、-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液（5248, 每100 mL含0.1 g十二烷基磺酸钠）；流速：1.0 mL/min；检测波长：354 nm；进样量：20 L；柱温：30。在此色谱条件下，样品中盐酸小檗碱色谱峰与其他组分色谱峰可达基线分离，且与其他相邻色谱峰分离度1.5；理论板数按盐酸小檗碱色谱峰计算2000。2.2 供试品溶液的制备2.2.11提取方法考察：供试品溶液制备精密量取三黄片1g，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声处理10 min，静置1 h，上清液用0.45 m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。提取方法 面积1 面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（mg/g）超声索氏
8、2.2.1.2提取时间考察提取时间（h） 面积1 面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（mg/g）0.511.52.2.1.3提取溶剂考察提取溶剂 面积1 面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.2 阴性对照溶液的制备按照三黄片处方，依制备工艺制备成缺盐酸小檗碱的阴性对照品，按供“2.2.1”法制成阴性对照溶液。2.2.3 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品6.2 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得248 gmL-1盐酸小檗碱对照品溶液。2.3 系统试应性试验精密吸取对照品、供试品及阴性对照2.4 线性关系考察精密吸取盐酸小檗碱对照品储备
9、液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，6.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取上述不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液20 L，注入液相色谱仪，测定峰面积，以盐酸小檗碱浓度为横坐标，盐酸小檗碱色谱峰面积为纵坐标，计算得线性回归方程为：Y=9.8516C+1.5232，r=0.9995；盐酸小檗碱线性范围为：6.2-148.8 g/mL。2.3.1提取溶剂考察进样量（ug） 2 4 6 8 10 峰面积甲醇乙醇2.5 精密度试验取盐酸小檗碱对照品溶液，重复进样6次，每次20 L，测定峰面积，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD%为0.46%，表明仪器精密度良好。2.6 稳定性试验
10、取同一供试品溶液于室温放置，分别在0、1、2、4、8、12 h进样测定，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD%为1.68%。表明处理后的供试品溶液在12 h内保持稳定。2.7 重现性试验取同一批号三黄片样品6份，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，各吸取20 L，按“2.1项”色谱条件进样测定，测得样品中盐酸小檗碱含量为0.13 mg/mL，RSD%为1.02%。2.8 加样回收率试验精密量取同一批号已知含量的三黄片样品6份（盐酸小檗碱含量为0.1326 mg/mL）,每份2.5 mL，精密加入盐酸小檗碱对照品适量，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，依“2.1项”色谱条件进样20 L测定，记录峰
11、面积，计算盐酸小檗碱含量与回收率。（见表1）表1 加样回收率试验结果（n=6）供试品 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD(mg) (mg) (mg) (%) (%) (%)2.9 样品含量测定分别精密量取3批三黄片1g，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按“2.1项”色谱条件进样测定峰面积，由外标法计算盐酸小檗碱含量。（见表2）表2 样品含量测定结果（n=3）制剂批号 盐酸小檗碱含量RSD(mg/mL) (%)大黄素和大黄酚含量测定1.材料和仪器1.1 仪器：高效液相色谱仪；TG-332 精密分析天平（上海天平仪器厂） ；超声波清洗器1.2 试剂：流动相所用甲醇
12、为色谱纯，其他试剂均为分析纯。1.3 试药：大黄素、大黄酚对照品 三黄片（三组 标记 第一组 第二组 第三组）2. 实验方法2.1 色谱条件与系统适应性：色谱柱：Dikma Diamondsil C18（250mm4.6 mm，5m） ；流动相：甲醇 -0.2%磷酸（85:15） ；流速：1ml/min；进样量：10l；检测波长: 254nm；柱温：35。理论塔板数 按大黄素峰计算不低于2 000。2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备：精密称取大黄素与大黄酚对照品适量，于50ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成含大黄素101.26g/ml、大黄酚109.24g/ml 的对照品贮备溶
13、液，再精密量取5ml 置10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成含大黄素50.63g/ml、大黄酚54.62g/ml 的对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备：取本品20 片，除去包衣，精密称定，研细（过3 号筛） ，精密称取适量（约相当于1 片的重量） ，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，密塞，称定重量，置超声清洗器中超声20min（超声功率为400W，超声频率为40kHz） ，放冷，用甲醇补足，减失的重量，滤过。精密量取续滤液10 mL，置于烧瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇- 盐酸（101）溶液15 mL，置于水浴中加热水解1h，立即冷却,用三氯甲烷强力振摇提取4d，每次15 m
14、L，合并三氯甲烷液，置于水浴上蒸干，残渣用无水乙醇- 乙酸乙酯（21）混合溶液溶解，移至25 mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.2.2.1 提取方法的考察：采用本法，三黄片要研磨成细粉，加甲醇在超声波仪上超声振荡20min 制备成供试品溶液，如超声少于20min，则溶解不充分，影响测定准确性，如多于20min，于测定结果无显著差异，一般选择20min 超声振荡即可。回流法是常用的提取方法，但大量有机溶剂的使用会导致环境污染，成本增加，有机溶剂残留等问题；相比较而言，超声法提取大黄素和大黄酚的含量与传统回流提取法提取后的含量相当，且较回流法大大缩短了时间，可操作
15、性强。提取方法 面积1 面积2 面积3 大黄素的含量（mg/g） 大黄酚的含量（mg/g）超声索氏2.2.1.2提取时间考察提取时间（h） 面积1 面积2 面积3 大黄素的含量（mg/g） 大黄酚的含量（mg/g）0.511.522.2.1.3提取溶剂考察提取溶剂 面积1 面积2 面积3 大黄素的含量（mg/g） 大黄酚的含量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.3 阴性对照溶液的制备：按处方比例称取缺大黄的其它药材，按中国药典一部三黄片“制法”项下方法制成缺大黄的阴性样品，按供试品溶液制备项下方法同法处理，即得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取对照品、供试品和阴性对照溶液各10l 进样测定，结
16、果阴性样品对测定无干扰。2.3 线性关系考察：分别精密量取含大黄素（101.26g/ml） 、大黄酚（109.24g/ml）的对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 置5ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成含大黄素20.25g/ml、40.50g/ml、60.76g/ml、81.01g/ml、101.26g/ml，含大黄酚21.85g/ml、43.70g/ml、65.54g/ml、87.39g/ml、109.24g/ml 的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10l，注入高效液相色谱仪,记录色谱图,并以峰面积Y 为纵坐标,大黄素、大黄酚的浓度 X(g/ml)为横坐标进行线性回归
17、。进样量（ug） 2 4 6 8 10 12峰面积2.4 精密度试验：精密吸取2.2.1 项下对照品溶液10l，按上述色谱条件连续进样6次，记录大黄素、大黄酚的峰面积。2.5 重复性试验：称取三黄片（第一号）样品5 份，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定大黄素、大黄酚含量。2.6 稳定性试验：取同一供试品溶液（第一号） ，分别在制备后0、2、4、8、12h 进样10l，记录峰面积，计算结果。2.7 加样回收率试验：精密称取已知含量（第一号）的样品细粉6 份，每份约1.5g，置圆底烧瓶中，并精密加入浓度为0.6457mg/ml的大黄素对照品溶液2ml 和浓度为0.9647
18、mg/ml 的大黄酚对照品溶液3ml，按2.2.2 项下方法制备供试液，测定峰面积。 表一大黄素加样回收率实验结果编号 称样量 （g） 样品中大黄素含量（mg）对照品加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）123表二 大黄酚加样回收率实验结果编号 称样量 （g） 样品中大黄酚含量（mg）对照品加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）1232.8 样品含量测定：取3 批（第一号 第二号 第三号）样品，每批3 份，均按2.2.2 项下同法操作，制备供试品溶液，测定其中大黄素、大黄酚的含量。表三样品含量测定结果组号 大黄素含量（mg/片） RS
19、D（%） 大黄酚含量（mg/片） RSD（%）第一组第二组第三组黄芩苷的定量检查1 仪器与试药11 仪器HP1100 型系列高效液相色谱仪 (美国) ; AE -240 电子分析天平 (瑞士 Mettler); KQ-250B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。12 试药黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所, 批号 0826-9502); 三黄片(南宁市冠峰制药有限公司, 批号 20090601 , 20090902 , 20090906 , 规格为每片片芯重 0.25g) ; 甲醇为色谱纯 (德国 M erck), 水为超纯水(韩国 Po w er Iplus 超纯水系统) , 其他
20、试剂均为分析纯。2 方法与结果21 色谱条件色谱柱: Hypersi l ODS2 ( 4.6mm # 200mm,5um ); 流动相: 甲醇 0.2 % 磷酸溶液 ( 45:55 );检测波长: 280nm; 流速: 1.0 mL/min; 柱温: 30 。进样量: 10uL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低 2500。在此条件下, 黄芩苷与相邻峰可达基线分离, 方中其他成分对测定无干扰, 2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备精密称取在 60 减压干燥 4h 的黄芩苷对照品约 20mg , 置于 50mL 量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度。再精密吸取 0.5 , 1.0, 2.0 ,
21、 4.0 , 6.0mL ,置 20mL 量瓶中, 配成各个浓度的黄芩苷对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备取本品 20 片, 除去包衣, 精密称定, 研细 (过三号筛) , 精密称取约 0.05g , 置具塞三角瓶中, 精密加入 70 %乙醇 50mL , 密塞, 称定重量, 超声提取 30min , 放冷, 补足重量, 过滤, 取滤液适量即得。提取方法 面积1 面积2 面积3 黄芩苷的含量（mg/g） 超声索氏2.2.1.2提取时间考察提取时间（h） 面积1 面积2 面积3 黄芩苷的含量（mg/g） 0.511.522.2.1.3提取溶剂考察提取溶剂 面积1 面积2 面积3 黄芩苷的含
22、量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.3 阴性样品的制备按处方比例制备缺黄芩的三黄片, 照 2.2.2 项下操作, 制备阴性样品溶液。2.3 线性关系考察分别精密量取各个黄芩苷对照品溶液 10uL , 依次进样, 测定峰面积。以测得的峰面积为纵坐标,对照品进样量( ug)为横坐标, 绘制标准曲线 , 求得回归方程 Y= 3 866.2 X 87.923 , r = 0.999 8 , 黄芩苷进样量在 0.1 1.2ug 内呈良好的线性关系。2.3.1提取溶剂考察进样量（ug） 2 4 6 8 10 峰面积甲醇乙醇2.4 精密度试验精密吸取同一批供试品溶液, 重复进样 6 次,依法测定, 黄芩苷峰面积
23、的 RSD= 0.6%, 结果表明仪器精密度良好。2.5 稳定性试验取同一对照品溶液 10uL, 按上述色谱条件分别在 0, 4 , 8 , 12 , 16 , 20h 测定 6次, , 记录峰面积积分值并计算出黄芩苷的 RSD = 1.1 % , 结果显示溶液 20h 内稳定。2.6 重复性试验取同一批号的供试品 6 份, 依法制成供试品溶液进行测定, RSD = 1.9 % , 结果表明重复性良好。2.7 回收率试验取已知含量( 14.26mg /0.293 4g) 的同一批号供试品 6 份, 分别精密加入浓度为 2 mg/mL 的对照品溶液 05mL, 照 2.2.2 项下操作, 制备样
24、品溶液。按色谱条件测定含量, 计算回收率, 结果见表 1。序号 取样量 样品中含量 测得量 回收率 平均回收率 RSD(g) (mg) (mg) (%) (%) (%)123注: 黄芩苷对照品加入量均为 1.000 0m g2.8 样品含量测定分别精密量取3批三黄片1g，按2.2.2项方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。序号 黄芩苷含量 RSD （mg/片） （%） 123参考文献：1.HPLC法测定复方苦参子洗液中盐酸小檗碱的含量-陶景芬2.薄层色谱法鉴别加味三黄片的有效成_省略_描法测定加味三黄片中小檗碱的含量-杨建明3.四季三黄片和四季三黄丸薄层色谱分析-宋文焕4. 四季三黄片质量控制方法的研究-卞艳晶5HPLC法测定三黄片中大黄素及大黄酚的含量-刘素兰6HPLC测定三黄片中大黄素_大黄酚及黄芩苷的含量-李淑盈7超声提取合HPLC 测定三黄片中大黄素和大黄酚的含量-王洁8. 高效液相色谱法测定芩玄颗粒中黄芩苷含量-李翔9. HPLC法测定产后补丸中黄芩苷含量- 袁萍10. HPLC法测定伤科跌打片中大黄素大黄酚的含量- 姜春霞
