1、第六章 卵子和胚胎的冷冻保存技术,一、卵子和胚胎冷冻保存的意义,采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196下停止代谢，而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。,（一）定义,1. 建立优良品种的胚胎库或基因库，保存动物品种、品系和稀有突变体；2. 运输胚胎代替活畜的运输，节省运输费用和检疫费用，减少疾病传播；3. 控制品种内的遗传稳定性和维持某些近交系动物的遗传一致性，节省大量时间和资金；,冻胚移植还有鲜胚移植所不可比拟的优越性。,（二）卵子和胚胎冷冻保存的意义,1952年，Smith报道用甘油作保护剂，对兔的受精卵进行慢速冷冻。但当时无法判定该技术是否成熟。1
2、972年，Whittingham等首次实现了小鼠胚胎的超低温冷冻保存，冻胚解冻后移植，产出正常后代。这种方法已广泛应用于牛、绵羊、山羊、马、家兔、猪等其它哺乳动物的胚胎超低温保存。,二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况,1985年， Rall和Fahy率先将玻璃化冷冻技术应用于鼠胚胎的冷冻保存。所谓玻璃化是指利用物理学原理，将高浓度的冷冻保护剂急速降温后，使其由液态转化为外形似玻璃状的稳定且透明的非晶体化固态，但并没有改变其在液态时的分子和离子分布。玻璃化可避免在细胞内形成冰晶而对细胞产生伤害。,二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况,冷冻和解冻处理尽管对胚胎有一定的损伤，但将解冻胚胎在体外培养一段时间
3、后可恢复正常的形态。目前，牛冷冻胚胎移植后的妊娠率与鲜胚移植的妊娠率相似。卵母细胞体积大，不易充分脱水，故冷冻不易成功。,二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况,Whittingham（1977）首次成功地冷冻保存小鼠卵母细胞以来，人们在此方面进行了大量的研究。玻璃化法冷冻的小鼠成熟卵母细胞体外受精及胚胎移植后产仔率已达20%38%。,二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况,目前已有关于人、小鼠、牛等卵母细胞冷冻成功的报道，但其成功率较低。于永存等（2002）报道，用玻璃化法冷冻保存牛GV期卵母细胞，解冻后其体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为21.6%、15.1%和11.1%，显著高于程序冷冻法和超快速
4、冷冻法的效果。,二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况,三、卵子和胚胎冷冻保存的原理,当生物细胞在水溶液中冷却时，细胞和培养液均先处于过冷状态，然后才发生冻结。在大多数情况下，细胞的过冷程度比周围溶液更深，细胞外溶液先结冰，使溶质浓缩，导致细胞外环境渗透压升高。若降温足够慢，可通过脱水来维持细胞内外环境渗透压平衡；但是降温过慢，细胞长时间处于高渗环境中易产生渗透休克；若降温过快，细胞内水分来不及移到细胞外而形成冰晶。胞浆内结冰过多会破坏细胞器，刺破细胞膜，导致细胞死亡。通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂，让细胞在保护剂中平衡并适当脱水，可降低其损伤。,一般卵子或胚胎在冷冻过程中不可避免要形成
5、细胞内冰晶，但只要不形成大冰晶，而是维持微晶（冰核）状态，细胞将不受伤害。胚胎在冷冻过程中，大约在-10以上细胞内不结冰，而在-10以下时，过冷胞质就形成冰晶。,三、卵子和胚胎冷冻保存的原理,冷冻可引起卵母细胞ZP收缩，破坏细胞骨架，损伤细胞膜和细胞内部结构的完整性，还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA不稳定性而导致染色体异常。为避免此类现象的发生，一般于-7时采用植冰法及时启动脱水过程，从而在较高的温度下诱导形成结晶，逐渐扩散至整个溶液，避免冰晶突然形成。,三、卵子和胚胎冷冻保存的原理,胚胎和卵子在冷冻和解冻过程中两次通过冰晶形成危险区（-15-50），采取适当冷冻方法和低温保护剂，使
6、其安全通过危险温区。进行冷冻处理前，向保存液中加入保护剂（如甘油），改变细胞膜渗透性和溶液渗透压，防止溶液效应和渗透压差异，减少降温和复温过程冰晶的形成。,三、卵子和胚胎冷冻保存的原理,常规冷冻保存胚胎是在胚胎脱水前诱导结晶，然后缓慢降温脱水，解冻时快速复温到常温。玻璃化法使用的玻璃化液是一种粘稠的玻璃态物质，低温时不结晶就可固化。胚胎在此溶液中脱水到一定程度，可引起内源性大分子和已渗入的保护剂浓缩，从而使细胞在急剧降温过程中得以保护。,三、卵子和胚胎冷冻保存的原理,四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法,（一）抗冻剂的种类,1. 低分子渗透型冷冻保护剂,甘油（GL）、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇（
7、PG）、乙二醇（EG）、1，3丁二醇（BG）、甲基溶纤剂（MC）、乙酰胺（AC）、聚乙二醇（PEG）等。,四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法,（一）抗冻剂的种类,抗冻物质一般为小分子物质，在0以上很容易通过细胞膜进入细胞质。加入保护剂后，细胞内部冰晶形成温度显著降低。此外，保护剂与水分子结合形成氢键，从而降低冻结部分电解质浓度，减少对细胞的损伤。,（1）小分子物质 单糖（如葡萄糖），双糖（如蔗糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖类。（2）高分子物质 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、白蛋白、左旋糖苷、聚乙烯醇（PVA）、羟乙基淀粉和蛋黄等。 主要通过改变渗透压，引起细胞脱水，从而发挥非特异性保护作用，又
8、称为细胞外冷冻保护剂。,2. 非渗透型冷冻保护剂,不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。但脱水过度，细胞也可能死亡。,理想的冷冻方案是：找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；合适的冷冻速率。,单一保护剂很难达
9、到胚胎或卵子的冷冻要求。在常规冷冻方法中，一般选择一种保护剂（如甘油或乙二醇）。在快速冷冻和玻璃化冷冻中常采用多种保护剂组成的混合保护剂，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亚砜等，再辅以糖类。,3.混合保护剂,低温保护剂的选择一般要考虑保护效果、胚胎毒性和脱除是否容易，要求所用冷冻保护剂的效果好，毒性低且解冻后易于脱除。,3.混合保护剂,Scholander等（1957）报道，北极鱼可以在-18的水中生存，它的血清的凝固点大约比这一温度高1，从这种动物体内分离一种抗冻蛋白（AFP）。目前，在植物、昆虫、细菌和真菌都发现并分离出AFP。,4. 抗冻蛋白（AFP）,AFP
10、是一种具有特殊功能的蛋白质，在低温（4）和超低温（-130-168）下，能与细胞膜相互作用而保护细胞，抑制冰晶的生长，增强生物体抵御寒冷的能力。,4. 抗冻蛋白（AFP）,Rubinsky等（1992）在冷冻液中加入AFP，对小鼠2-细胞阶段胚胎进行冷冻保存，解冻后囊胚发育率高达82.5%。应用鱼的AFP已经成功地玻璃化冷冻了牛和羊的胚胎及猪的卵细胞。费云标等（1995）报道，使用植物AFP可提高猪胚胎冷冻保存后的成活率。,4. 抗冻蛋白（AFP）,（二）冷冻保护液,由基础液和一定量的冷冻保护剂配制而成。台氏液、杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、TCM-199、牛卵泡液、Hepes缓冲液或TALP
11、液等。最常用的是经过改良的PBS液，即mPBS。使用时通常还加入一定量的同源或异源动物灭活血清或BSA。,不同种类和浓度的冷冻保护剂配制成的冷冻保护液对各种动物胚胎的保护效果不同。即使是同一保护液对同一动物不同来源和不同发育时期的胚胎保护效果也有差异。,（二）冷冻保护液,此外，用冷冻保护液对胚胎冻前处理的时间、温度，平衡的时间和温度等对也影响其效果。冷冻保护液的配制要求无菌操作，量取选用的保护剂和灭活犊牛血清，加入PBS在容量瓶中定容，混合均匀后，用G6滤器抽滤灭菌。分装到2ml的安瓿中，火焰封口，4冰箱保存备用。,（二）冷冻保护液,现有保存方法有4种常规冷冻法；一步冷冻法；程序冷冻法玻璃化冷
12、冻化 着重讲述后两种,（三）保护方法,1.常规冷冻法,也叫慢速冷冻法、逐步降温法。基本步骤： 1. 将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂（甘油或二甲亚枫（DMSO）等）浓度的三种冷冻液中（冷冻液浓度由低到高，最终浓度1.4M），每种冷冻液中平衡5分钟。 2. 然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以13C分下降至-6-7，在此温度诱发结晶，平衡10分钟。,1.常规冷冻法,3. 以0.3分的速率降温至-35- 38，之后投入液氮中保存。4. 胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20血清的PB
13、S保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0.5M(或1.0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。,2.一步冷冻法,也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。,3. 程序冷冻法,也叫慢速冷冻法、逐步降温法。所用冷冻保护剂一般为： 二甲亚砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、1,2-丙二醇等。该法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此
14、法进行胚胎冷冻。影响因素包括：抗冻保护剂的选择与浓度、植冰和降温速度、解冻方法、抗冻的脱出等。,将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次讲洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻中平衡20min将胚胎和冷冻液装入0.25ml胚胎冷冻细管中，封口，并在细管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等将装入胚胎的习惯放入冷冻仪中，在0平衡10min，以1|min的速度降至-7-6，并在此温度下诱发洁净，平衡10min，然后0.3的速度降温至-38-35，投入液氮保存。,基本步骤：,3. 程序冷冻法,解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10
15、s，立即至于37水浴解冻，1min后取出完成解冻过程。将细管中的冷冻液及胚胎推出，在现实镜下找到胚胎并移入解冻液。采用三步法脱除甘油，每步5-7min。最后用PBS液将胚胎洗3-5遍，供移植备用。,基本步骤：,3. 程序冷冻法,4.玻璃化冷冻法,将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液态变为透明的固态，形成玻璃化。这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪器。是近年来发展起来的一种新的方法。,基本步骤将胚胎在含20
16、%小妞血清的PBS溶液中清洗两次；将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10min；将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS溶液中，立即转入胚胎冷冻习惯。,4.玻璃化冷冻法,基本步骤将习惯在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速投入20温水中，摇动细胞管使其解冻均匀将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植,4.玻璃化冷冻法,体视显微镜,胚胎装管,细管胚胎上 塞,细管胚胎,便携式胚胎程序冷冻仪,装待冷冻的胚胎细管,程序冷冻的细管胚胎在液氮保存,从液氮中取出胚胎细管待用,细管冷冻胚胎35度解冻,
