1、河 南 科 技 大 学毕 业 论 文牡丹组织培养技术的研究概述姓 名 许明刚 院 （系） 林学院 专 业 园林 指导教师 高水平 2012 年 5 月 10 日毕 业 设 计（ 论 文 ）任 务 书填表时间： 2012 年 3 月 15 日学生姓名许明刚专业班级园林本 102指导教师高水平课题类型论文设计（论文）题目 牡丹组织培养技术的研究概述主要研究内容1.牡丹组织培养技术的研究现状；2.牡丹组织培养中常见问题及注意事项；3.牡丹组织培养发展前景。主要技术指标( 或研究目标)进度计划主要参考文献教研室主任签字： 年 月 日牡丹组织培养技术的研究概述摘 要牡丹是我国名花，传统繁殖方式不仅成苗周
2、期长，而且出苗量少，质量参差不齐，难以满足生产需要。因此，用组织培养的方法对牡丹进行繁育，成为牡丹商品化和产业化发展的必然趋势。文中对牡丹组织培养近 30 年的研究进展进行了综述，主要有：牡丹组织培养过程中外植体的选择与消毒技术、培养基选择的、培养条件、生根转移培养等各个操作阶段的技术要领，包括牡丹品种、部位的选择，培养基植物调节剂的添加量，培养环境中温度、光照等条件的控制以及生根过程中促进生根措施等。此外，对愈伤组织的诱导，花粉和花粉培养，胚培养等多种组培方法的研究也进行了全面的总结。同时也指出整个操作过程中的主要问题所在：玻璃苗、褐化等一系列的影响因素。目前，牡丹的组织培养仍然处于研究阶段
3、，存在许多不完善的领域，通过对前人研究成果的总结，为今后牡丹组织培养工作的进一步开展提供借鉴，推进牡丹组培技术的发展。关键词：组织培养； 牡丹； 植物STUDY ON TISSUE CULTURE TECHNIQUES FOR 4PEONYABSTRACTThe peony is Chinas famous flowers, traditional breeding methods not only seedling period is long, and the emergence of the quantity is little, quality is uneven, it is dif
4、ficult to meet the need of production. Therefore, using tissue culture method for breeding of peony, peony commercialization and industrialization has become the inevitable trend of the development of. In this paper, the peony tissue culture in recent 30years were reviewed, mainly include: Peony exp
5、lant selection and sterilization technology, selection of culture medium, culture conditions, the transfer of cultured rooting each operation stage of the technical essentials, including peony varieties, site selection, medium, plant growth regulator added in the culture environment, temperature, il
6、lumination control and during Rooting rooting measures. In addition, the induction of the callus, pollen and pollen culture, embryo culture and other culture research methods also undertook comprehensive summary. At the same time also pointed out that the entire operation process of the main problem
7、s: the vitrification, browning and a series of factors. At present, the peony tissue culture is still in the research stage, there exist many imperfections in the field, this paper, for the future of peony tissue culture work further development for reference, promote the peony tissue culture techno
8、logy development.KEY WORDS: peony; tissue culture; plant目 录摘要 Abstract51 前言 .12 牡丹组织培养技术各个阶段研究 .22.1 牡丹组培技术研究进展 32.2 外植体选择的研究 32.3 培养基选择的研究 42.4 培养条件的研究 42.5 生根培养与移栽 43 牡丹不同组培方法的研究 .53.1 牡丹愈伤组织培养的研究 53.2 花粉和花粉培养的研究 63.3 胚培养与体细胞培养的研究 64 牡丹组织培养过程中常见问题 .74.1 玻璃化现象 74.2 褐化现象严重 84.3 生根率低以及生根质量不高 84.4 牡丹组
9、培苗移栽成活率低 84.5 体胚诱导率低且畸形体胚多 95 总结及展望 .9参考文献 .11致 谢 .1211 前言牡丹（Paeonia suffruticosa Andr），别名富贵花、百两金、木芍药，为芍药科芍药属植物，为我国的传统名花。其花朵硕大，雍容华富，作为文明、和谐、繁荣、富强的象征，在国内外有广阔的文化市场需求。牡丹不仅有极高的观赏价值，还有相当重要的药用价值。牡丹传统的繁殖方法有有性生殖中的种子繁殖，无性繁殖中的分株、压条、嫁接繁殖等 1。然而，这些繁殖方法因受到各种因素的影响，且多种牡丹结实率低甚至不结实，且种子发育不良，用种子繁殖难以获得优良植株，无性繁殖则因受生长季节的限
10、制、繁殖系数小、形不成规模，而无法满足市场的需求。利用组培技术繁殖牡丹，有周期短，繁殖系数高，便于大规模生产，因此，各种牡丹品种群的组培技术已经成为主要的研究方向。自 1984 年李玉龙等 4人报道了牡丹快繁技术的研究，之后英国、法国、美国、荷兰、朝鲜及日本等国家也进行了研究。20 多年来，中外学者对牡丹的组织培养进行了大量的工作，均取得了不同程度的进展。目前利用组培方法，已经能育成生根的组培苗，但由于组培苗过渡到商品苗还存在许多问题，组培苗的生根、炼苗、出瓶，褐化现象的控制等都需要进一步研究。国内组培苗还没有形成商品苗批量生产。2 牡丹组培技术的研究现状2.1 外植体的选择我国是牡丹第一资源
11、大国，现有四大品种群近千个牡丹品种，但真正用于组培研究的却非常少，与我国丰富的牡丹资源极不相称。常见的有洛阳红、姚黄、凤凰山牡丹、青龙卧墨池、十八号牡丹、黑花魁、豆绿、金星雪浪、大胡红、荷花紫、枯枝牡丹等，这在一定程度上反映出目前的牡丹组培研究工作还处于初级阶段，研究的广度有待加强。目前，牡丹组织培养采用的外植体多数主要有顶芽、腋芽、萌蘖芽、花芽和萌生条等，其中萌蘖芽的效果最好，分化高，花芽最差。不同取材时期对芽的培养也有影响，12 月至次年 2 月份取材，外植体污染率低，成活率高，萌发时间早，生长迅速，植物健壮，培养效果最好 2。这是因为冬天温度低，将土壤以及植株2上附着的细菌、病毒等生物冻
12、死，减少了污染源；另外，低温过程导致植株及芽内的激素含量发生动态变化，促进萌发和生长的 IAA，GA 3增多，抑制萌发和生长的 ABA 减少，从而改善了芽外植体的培养效果 3。2.2 外植体灭菌技术的研究牡丹芽体上或芽体内的菌类物质是外植体消毒困难的主要原因。常用的消毒剂有酒精、升汞（HgCl 2） 、次氯酸盐、酒精和升汞混合液等。消毒剂的浓度和处理时间因品种、外植体类型、取材时期不同有一定的差异。植物组培常用的消毒剂如表 14，所示常用消毒剂的使用方法及效果消毒剂 使用浓度/% 消毒时间/min去除的难易消毒效果 对植物毒害升汞 0.1-0.2 2-10 较难 最好 剧毒酒精 70-75 0
13、.1-1 易 好 有次氯酸钠 2 5-30 易 很好 无漂白粉 饱和溶液 5-30 易 很好 低毒过氧化氢 10-12 5-15 最易 好 无新洁尔灭 0.5 30 易 很好 很小硝酸银 1 5-30 较难 好 低毒抗菌素/(mgL -1) 0.4-5 30-60 中等 较好 低毒表 1目前，比较成熟的灭菌技术主要包括以下几步：用自来水将外植体表面冲洗干净；用适量洗涤灵溶液浸泡 20min，用毛刷轻轻洗去鳞片包裹的尘土，用流水冲洗 10min；接着在超净工作台上进行灭菌；用无菌水 3-5 分钟以清除残余消毒剂；剥去芽外部包裹的鳞片即可接种。尤杨等以牡丹顶芽为外植体，选用 0.1%HgCl2消毒
14、剂，研究了不同消毒处理时间 4min、6min、8min、10min、12min 对顶芽污染率、褐化率及存活率的影响，实验结果表明：用 0.1%HgCl2处理牡丹顶芽，时间在 8min 为最理想的消毒处理时间。其中，随着消毒时间的延长，污染率呈由高到低的趋势，而褐化率却呈由低到高的趋势，存活率则是先升高，再下降 5。2.3 培养基选择的研究3目前，牡丹的组织培养主要采用 MS 培养基，附加不同的生长调节物质。但该培养基无机盐浓度过高，可能引起酚类外溢物质的大量产生而导致褐化，于是人们将 MS 培养基成分减半，形成 1/2/MS 培养基，被大量使用。蔗糖作为碳源也经常被添加到培养基中，浓度多在
15、2%-3%的范围内。在牡丹组织培养中，植物生长调节剂物质用量虽少，但却发挥着重要的调节作用。一般认为，生长素能促使细胞进入持续分裂增殖状态，提高增殖倍数，而细胞分裂素促使细胞进入分化状态 6。常用的生长素有萘乙酸(NAA 0.1-1.0mg/L)、吲哚乙酸（IAA 0.1-2.0mg/L） 、吲哚丁酸（IBA 1.0-2.0mg/L） ，被采用的频率依次递减。除此之外，有研究表明在初代培养中对愈伤组织增殖最有效的是 2，4-D,但它同时也是一种器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽的分化。在细胞分离素中，以 6-BA 使用最频繁，浓度范围 0.2-2.0mg/L7。在牡丹组织培养过程中严重的褐化现
16、象在很大程度上抑制了培养材料的再生、降低了增殖系数。为此，一些抗氧化剂与吸附剂也被加入培养基中。何松林 8等通过研究得出，1000-1500mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）对褐化的抑制效果最好。此外，还有硫代硫酸钠、维生素 C，活性炭能够清除培养材料在代谢过程中产生的毒副物质、调剂激素供应，因此也有利于褐化的抑制，用量为 0.3%-0.5%。2.4 培养条件的研究研究表明，牡丹组培所需温度以 24-26最为适宜，超过 26就会刺激玻璃化苗的产生，温度较低则会降低光合作用，抑制试管苗的生长 9。同时，在组培过程中，亦应注意昼夜温差的控制。昼夜无温差会导致物质积累减少，叶绿素含量减少，酶功能失调
17、，蛋白质含量降低，从而导致玻璃化苗的产生。通过变温处理，加大昼夜温差会使该现象小时。此外，在光照条件上，牡丹组织培养适宜条件为 2000Lx、10h/d。但在凤丹组织培养中，叶侠清等发现在 29、黑暗条件下培养可显著提高牡丹根皮愈伤组织的增长倍数和丹皮酚含量 10。湿度方面，一般认为采用通透性较好的棉塞等封口材料有利于培养材料的光合干物质积累，降低湿度，减少玻璃化苗的发生。2.5 生根培养与移栽牡丹组培苗生根培养中常用到的培养基有 MS、1/2MS。IBA 有较好的促进植物生根的作用，此外也有使用 NAA 或 IAA 诱导生根的报道。IBA 作为生根诱导剂，4使用方法有三种：一步生根法，即将未
18、生根的组培苗接种在含 IBA 的培养基中，进行长时间的培养；速蘸法，即将用于生根的组培苗的基部在一定浓度的 IBA 溶液中浸泡一段时间，然后接种在含有活性炭而不含有生长素的培养基中培养生根；二步生根法，即先将未生根的组培苗接种在含一定浓度 IBA 的培养基中进行一段时间诱导，然后转入含有活性炭而不含生长素的根形成培养基中培养。实验表明，两步生根法效果最好 11。周仁超等人以紫斑牡丹胚为材料，在 1/2MS+IAA0.2mg/L 的培养基上获得了90%以上的生根率。曹小勇等使用相类似的材料进行研究时却发现，在添加BA0.1mg/L 的 MS 培养基中，紫斑牡丹胚的上下胚轴及胚根均可正常生长，有些
19、还可形成完整的幼苗。另外，张桂花等以黑花魁等品种的顶芽或腋芽为材料进行实验，结果表明：单一的生长激素无法促进生根。从生根培养的流程来看，一般认为，当生长素完成诱导作用后会对新根的生成有抑制作用 12。因此，现在根诱导培养基培养的基础上，转移到不含激素但含活性炭的根形成培养基上培养的两步料续生根法对促进牡丹组培苗生根最为有效。相对而言，一步生根法难以消除培养后期生长素的抑制作用，而速蘸法的缺点在于难以充分发挥生长素的诱导作用。牡丹组培苗根长约 3-4cm 时，从培养室取出，置于 4进行低温处理，之后在散射光下封闭瓶口练苗，并逐渐去掉封口材料。练苗时间的长短对生根苗移栽成活率有很大影响，适当延长练
20、苗时间，可以提高移栽成活率 13。生根苗移栽应选择凉爽的季节，以春季和秋季为好，此时温度适宜，昼夜温差较大，有利于移栽苗的生长。孔祥生经过实验得出，在腐殖土上的移栽成活率为 48%，而蛭石作基时的移栽成活率为 33%，相比之下，腐殖土较好。3 牡丹不同组培方法的研究在植物组织培养过程中，依据外植体来源不同，植物组织培养可以分为愈伤组织培养、器官培养、花药和花粉培养、胚培养、细胞培养、原生质体培养。3.1 牡丹愈伤组织培养的研究1965 年 Partanen，1969 年 Demoise 和 Partanen 分别以牡丹种子的合子胚为材料，诱导出了愈伤组织，得到二倍体和四陪体的混合细胞团，但没有
21、器官发生活任何形态发生的报道。Gildow 和 Mitchell 用牡丹白化茎为外植体进行组培培5养，比较了 2SH 和 SH-M 两种培养基（氮含量基本相同，前者为 5000mg/L KNO3，后者为 2500mg/L KNO3和 1650mg/L NH4NO3）的效果，发现含有还愿态氮和氧化态氮 SH-M 培养基更利于愈伤组织的快速生长 14。Wang and van Staden 报道，2，4-D 能促进凤丹白种胚的子叶两端形成愈伤组织。在凤丹组培中，张子学等 15采用种子、种胚以及由此产生的子叶、叶柄、叶片和愈伤组织等作为外植体进行芽的诱导，发现采用胚培养可以打破胚轴休眠，缩短初代培养
22、周期。叶侠清等在牡丹愈伤组织诱导方面得出，在胚、上胚轴、腋芽、顶芽、土芽、叶片、叶柄、心皮、花药等外植体中，以土芽的诱导率最高。Margherit Beruto 等经过进一步研究表明，带有展开叶片的芽比仅具有幼叶原基的芽更容易启动组培过程。分析认为土芽的组织分化程度最低，最容易脱分化产生愈伤组织，是最理想的外植体材料。陈怡平 16等以紫斑牡丹土芽、叶柄、叶片、心皮、和雄蕊为材料进行愈伤组织培养，发现愈伤组织诱导中，NAA 的作用大于 BA 的作用；NAA 浓度稍高于 BA浓度比较理想；土芽和顶芽的诱导率最高，适合做外植体。牡丹组培中，诱导产生愈伤组织比较容易，而由愈伤组织分化不定芽却比较困难，
23、不定芽分化率一般比较低。李玉龙等人诱导牡丹嫩叶和叶柄产生愈伤组织，并分化成不定芽，实现了少量的植株再生；他得出叶柄的愈伤诱导率及愈伤分化率都显著高于嫩叶。李艳敏诱导紫瑶台叶片愈伤组织的不定芽分化率最高仅为10.0%。可见，牡丹组织培养中，由愈伤组织再生植株的途径还需要深入研究。3.2 花粉和花粉培养的研究芍药属植物具有多核或多细胞花粉的现象，表明其具有较明显的体胚发生潜能，为进行体胚发生研究创造了条件 17。1975 年 Zenktleler 等研究了P.suffruticos 和 P.lutea 花药的离体培养，在培养基 MS+3%蔗糖+500mg/L 水解酪蛋白+1mg/LKT+1mg/L
24、IAA 中培养 3 周后，观察到多细胞和多核的花粉粒；6 周后，2%-3%的花粉形成了多细胞的胚状体，但它们始终包被着花粉外壁，没有完成器官分化。Roberts 和 Sunder-land 在不添加碳和琼脂的 MS 液体培养基中，成功获得了 P.delarayi 的花粉胚。但是，由花粉分化出器官，从而完成植株再生的过程在牡丹方面尚未有研究结果公布。3.3 胚培养与体细胞培养的研究为了改变牡丹种子休眠的习性，国外学着进行了胚培养的研究。胚培养技术6是指将植物的种胚接种在无菌的条件下进行培养，使之生长发育成幼苗的技术。1976 年 Zillis 和 Meyer 报道，胚的离体培养可以将萌发时间由
25、8 个月缩至 12-14 周,大大加快了育种进程。黄守印和周仁超研究了不同基因型的牡丹成熟胚的胚培养，通过丛生芽和不定芽的产生，获得了较高的增殖率。周仁超将丛生芽切成分成单芽，诱导生根，生根率达 90%以上，大大提高了成苗率，何桂梅等对几种日本牡丹的幼胚（65 天）进行培养，发现启动培养基、基因型与胚的发育时期是影响幼胚立体生长的重要因素；但幼胚培养成苗率低，只有 10%左右。而紫斑牡丹和山牡丹近成熟胚（花后 90 天）的离体培养，分别获得了 71.6%和 63.6%的成苗率 18。说明幼胚不是牡丹胚培养的理想材料；发育后期的材料适合用作胚培养。体细胞胚发生是细胞全能性表达最完全的一种方式 1
26、9,与诱导器官分化相比，体细胞胚遗传性相对稳定，不容易发生突变，在适宜的条件下很容易长成独立植株，成苗率较高，可加快繁殖优良种质并保持其遗传性。近年来，分子生物技术的迅猛发展和广泛应用，使体细胞胚发生的研究进入一个崭新的阶段。牡丹方面，何桂梅以两种日本牡丹的幼胚以及牡丹的和紫斑牡丹近成熟胚为外植体，首次成功诱导出牡丹的体细胞胚，在 1/2MS+BAP0.5mg/L+CH500mg/L+蔗糖 10%的培养基中，4 种牡丹的体胚诱导效果均较好，分别达 27.3%，20.0%和 10.0%，将诱导出的体胚分割下来单独培养，紫斑牡丹的体胚 5.8%能再生成苗。该项研究填补了牡丹体胚发生方面的空白，为牡
27、丹的分子育种奠定了一些基础。4 牡丹组织培养过程中常见问题牡丹的育种和繁殖一直是生产和科研的主要内容，也是牡丹走向商品化和产业化的重要前提。组织培养及生物技术的发展将作为牡丹育种和繁殖提供重要的技术基础。牡丹组织培养技术发展至今，仍存在诸多问题，没有形成健全的体系，限制了它们在实践中的应用。4.1 玻璃化现象在植物组织培养过程中，叶片和嫩梢呈透明或半透明水浸状的培养物，称为玻璃化苗。玻璃化是植物组织培养过程中的一种生理失调和生理病变，在牡丹组织培养过程中也普遍发生。整体植物与受冻害植物极其相似，从外部叶片坏死并7逐渐发展到整株坏死，给牡丹组培带来极大的浪费。1992 年河南师范大学的储成才、李
28、大卫 20首次报道了组培中产生玻璃化现象，并对其原因做了初步调查。在试验中发现：NAA、6-BA 等单独或相互作用，均不会有玻璃化的发生；温度的高低与玻璃苗的产生有很大的关系，在 26以下没有玻璃苗的产生，当温度在 26-30范围内，组培苗则会发生玻璃化现象，且随着温度的升高，玻璃化的发生频率也随之升高。4.2 褐化现象严重在牡丹茎尖培养中，80%以上都会产生褐色物质，严重时导致织物材料死亡。众多问题中，褐化就是其中最主要的瓶颈之一，因此对褐化的防止不容忽视。何松林等以叶柄离体培养材料为实材研究了硫代硫酸钠、维生素 C 和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）对褐化的抑制作用。结果表明，这三种抗氧化剂与吸附
29、剂对褐化的抑制作用依次增强，其中以 1000-1500mg/L PVP 效果最好。北京林业大学李萍等人研究了活性炭、硝酸银、PVPP 和 VC 四种防褐剂对牡丹品种“乌龙捧盛”组培中褐化控制的作用及对组织培养苗生长和增殖的影响。结果表明：褐化集中发生在接种后四天内。活性炭能有效控制褐化，但是长时间的处理对组培苗的生长有一定抑制作用 21。所以活性炭的添加量不宜过高，一般为 0.3%-0.5%。而硝酸银能明显减轻褐化，PVPP 能部分控制褐化，VC 则对褐化的控制效果不佳，且容易导致苗玻璃化。有的学着从防止褐化的角度进行研究，得出幼茎在组培过程中褐化的可能性最小，最适宜作为外植体，另外，接种或转
30、接初期进行 5-7d 的暗培养，然后转入正常培养环境中，可以减轻组培苗的褐化程度，而不影响组培苗的生长和增殖。4.3 生根率低以及生根质量不高生根问题是牡丹离体快繁中存在的主要问题，也是制约牡丹离体快繁体系建立的最大瓶颈。一是生根率不高，甚至一些品种尚未获得生根苗；二是生根质量不高，部分不定根愈伤组织产生，根与茎中间形成离层，缺乏疏导组织的联系，且不定根易脱落，影响了下一步的移栽工作。84.4 牡丹组培苗移栽成活率低移栽成活率低，是牡丹组织培养最大的限制因子，一方面与不定根质量不高有关，另一方面与组培苗生根后发生休眠有关。只有提高不定根的质量并采取适当的方法打破芽的休眠，提高组培苗适应环境的能
31、力，才能切实提高移栽成活率。4.5 体胚诱导率低且畸形体胚多目前，芍药属体细胞胚发生的研究还比较少，且绝大多数以芍药为研究对象，牡丹方面的研究才刚刚起步。芍药属体胚诱导率很低，畸形体胚多，导致植株再生困难。因此，提高体胚诱导率，同时减少畸形胚的比率，是今后体细胞生成研究要重点解决的难题。5 总结及展望正如我们看到的，牡丹的组织培养技术仍存在许多需要研究和解决的问题，并且这些问题的解决可能需要很长一段时间才能实现，但该技术应用于生产实践、服务于生产实践已经成为今后的必然趋势 22。组织培养和愈伤再生途径将为结实困难的牡丹品种提供一条新途径。胚珠和胚培养技术用于辅助育种，可以缩短育种年限，挽救杂种
32、胚，提高育种效率。体细胞胚发生技术将为牡丹繁殖及通过生物技术进行牡丹育种创造条件。因此，牡丹组织培养的研究，道路虽然艰辛曲折，但一定会成功。今后牡丹组培研究的重点为：试管苗的褐化、玻璃化现象研究；壮苗的培养研究；驯化移栽条件研究；体细胞胚胎发生研究；协调实验室研究与工业化生产之间的配套，即中试研究 23。此外，需要提出的一点是，为了加速牡丹产业化的发展，中国洛阳牡丹园于2004 年 6 月开始投入运行牡丹植株组培工作 20。该项研究主要分为 4 个阶段进行。第一个阶段是培养物的建立，即选择适合的外植体。为了保证培养物的无菌性，对外植体的消毒方法、时间都需要一个摸底过程，找出一个最佳的方法。第二
33、个阶段是茎芽的增殖方法。通过诱导不定芽，实现增殖和增强腋芽生枝能力的方法。第三个阶段是离体植株的生根。在有细胞分裂素存在的情况下，由不定芽9和腋芽生长成的枝条一般都没有根，为了得到完整的植株，必须把植株转入生根培养基中。第四个阶段是生根苗的转载。把植株由试管移栽入土，此环节需谨慎处理。牡丹试管苗的生根和移栽是一项非常艰巨的工作，也是影响牡丹组织培养的关键所在。10参考文献1 高志民，王雁.牡丹、芍药繁殖技术育种研究J.北京林业大学学报，2001，23（4）：75-79.2 陈世昌.植物组织培养.重庆大学出版社M，2006.7.3 王二强，王占营.国内外牡丹组织培养技术研究现状.内蒙古农业科技2
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