1、1第七章 动物基因工程世界第一只转基因动物：转入生长激素基因的小鼠世界首只转基因灵长类动物安迪2001 年月日，美国科学家宣布培育出了世界上首只转基因猴 “安迪 ”。 此项成果将为人类最终战胜糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症和艾滋病等顽症提供帮助。在 “安迪 ”体内的是一种绿色荧光蛋白（）标志基因。研究人员共对只猴子的卵母细胞进行了转基因处理，接着对挑选出的个转基因卵母细胞进行人工授精，然后把这个受精卵分别植入只代孕猴妈妈的子宫中，结果共有只猴妈妈怀孕。但其中有三只小猴不幸夭折，还有一只未获成功，只有 “安迪 ”不仅产下后身体健康，而且转基因特征明显。转入荧光蛋白基因的兔子和鼠2000 年，法国科学
2、家利用基因技术 “制造 ”出了一只可以发出绿色荧光的兔子 “Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子 Alba。 第一节 动物基因转移的选择标记一、嘌呤和嘧啶的生物合成嘌呤核苷酸生物合成途径从头合成途径5-磷酸核糖-1-焦磷酸（ PRPP） 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP） AMP、GMP补救合成途径：次黄嘌呤核苷（HR） 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP） AMP、 GMP嘧啶核苷酸生物合成途径从头合成途径尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）补救合成途径胸腺嘧
3、啶核苷（TR） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（ TMP）二、胸腺激酶基因选择系统选择 TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hypoxanthine) 、氨基蝶呤 (aminopterin)和胸苷(thymidne)，所以叫做 HAT 选择法。基本原理是，如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(APT)处理细胞， 二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从 dUMP 合成 dTTP，2以及 dATP 和 dGTP 的重新合成便因此被阻断。但次黄嘌呤是 dATP 和 dGTP 补救合成途径的一种底物，培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出这些脱氧嘌呤三磷
4、酸(dATP 和 dGTP)。同时，由于在 HAT 培养基中补加有外源的胸苷，所以 TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为 dTTP，继续存活下去；而 TK细胞则不会发生这种合成，因而死亡。 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk - ）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 tk 能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT 培养基）生长，载体上的标记基因hprt 与之遗传互补哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
5、氨基糖苷磷酸转移酶二氢叶酸还原酶潮霉素 B 磷酸转移酶胸甘激酶基因黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶腺苷脱氨酶第二节 病毒载体实验证明，一些真核生物的病毒，经过改建之后，都可以发展成为用于转移动物基因的分子载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点：动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。3病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒 DNA 形成的假病毒颗粒，即构成了一种高效
6、的转化体系。一、SV40 病毒载体 猿猴空泡病毒 40(Simian vacuolating virus 40, SV40)是迄今为止研究得最为详尽的乳多空病毒(Papova viruses)之一。SV40 病毒的基因组是一种环形双链的 DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。1.SV40 病毒的基本生物学特性 SV40 病毒是一种小型的 20 面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质 Vp1、Vp2 和 Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组 DNA。同其它病毒不同，SV40 DNA 是同除了H1 之外的所有寄主细胞组蛋白 (H4、H2a、H2b 和 H3)相结合。这些组蛋白使病毒
7、 DNA 分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后的 SV40 基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40 病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。 图2.SV40 病毒载体野生型的 SV40 病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组 DNA 就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，SV40 还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受体细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的SV40 病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有
8、用载体。目前设计的以 SV40 为基础的基因克隆载体，主要有两种不同的类型：取代型的重组病毒载体；重组的病毒-质粒载体（1）取代型的重组病毒载体。外源 DNA 是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。由于插入的外源 DNA 片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体 DNA 能够在哺乳动物的受体细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充这段被取代的病毒基因组 DNA 的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。晚期区段取代载体实验中已经观察到，缺失了整个晚期区段功能的 SV40 病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感(ts)的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区
9、段的途径构建 SV40 病毒载体。最常用的辅助病毒是 tsA 突变体，它合成一种温度敏感的 T 抗原。图早期区段取代载体按照同样的道理，也可以构建出早期区段取代载体。当 SV40 病毒的早期区段被取代后，就失去了 T 抗原的功能，因此，早期区段取代载体必须使用具有互补功能的辅助病毒。这自然显得比较麻烦。1981 年 Y.Gluzman 发现了一种特4殊的 COS 细胞系，能够有效地互补 T 抗原，从而大大地方便了早期区段取代载体的使用，被认为是 SV40 载体发展历程中的一个重要的突破。（2）重组的病毒-质粒载体第二种是重组的病毒-质粒载体。在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细
10、胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的 DNA 分子载体。含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体SV40 和多瘤病毒(polyoma virus)的基因组能够在寄主细胞中快速地复制，并达到相当高的拷贝数。利用这种能力，现在已经发展出了一类特殊的病毒载体。这类病毒载体，实质上是由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做病毒-质粒载体(viral-plasmid vector)。由于它们既可在大肠杆菌细胞中复制，也能在哺
11、乳动物细胞中复制，根据这种特性，在有的文献中有时也称之为穿梭载体。图：病毒-质粒载体 pC10 就是一种典型的穿梭载体，其中的早期区段和复制起点来自多瘤病毒，质粒是大肠杆菌的 pBR322，克隆的外源 DNA 是小鼠免疫珠蛋白重链基因。微型病毒复制子-质粒载体实验发现，在 COS 或 HFS 细胞中，含有 SV40 DNA 复制起点的任何大小的环形DNA，都能够像质粒一样进行独立的复制。根据这种原理，许多实验室都把只含有 SV40复制起点的 DNA 片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viral replicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒-质粒载体，称为微型病毒复
12、制子- 质粒载体。图：pTBC-1 就是一种典型的 SV40 微型病毒复制子-质粒载体，如果将这种载体导入 COS或 HFS 细胞，它们就能利用细胞提供的 T 抗原复制出非常大量的拷贝数。所以可以用来高水平地表达外源蛋白质。 二、反转录病毒载体 反转录病毒(retroviruses)是一类含单链 RNA 的动物病毒。它的基因组含有 2 条相同的正链RNA 分子，包装成二倍体病毒颗粒。迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒，例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)等等，但其中研究得最为详尽的则要数劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus， RSV)。R
13、SV 病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的 DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。反转录病毒具有许多优点，便于发展作为动物基因克隆载体。第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。5第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。1.反转录病毒的生命周期一种典型的反转录病
14、毒的生命周期，是从它的感染颗粒同寄主细胞表面待定的接受器结合，并进入细胞的时候开始的。整个周期可以分为两个时期。在第一时期，首先是在细胞质中的病毒颗粒脱掉蛋白质外壳，释放出的()RNA 在反转录酶作用下，合成()DNA。 ()RNA 链通过反转录酶加工作用，被逐渐地降解掉。剩下的()DNA 继续指导反转录酶合成()DNA。最终形成的双链形式的 DNA 分子整合到寄主细胞的染色体基因组上，成为原病毒(provirus)。在双链形式的 DNA 进入寄主细胞核成为原病毒之后，便开始了反转录病毒生命周期的第二时相。此时，原病毒 DNA 进行活跃的转录，合成出来的转录本被加工成 mRNA，进而转译为 2
15、 种成品蛋白质(finished proteins) 和 2 种聚合蛋白质(polyproteins) 。病毒颗粒是在细胞质中组装的，成熟后即通过出芽(budding)的形式从感染细胞中挤压出去，而细胞本身并没有任何损伤，因此可以长时间持续地释放病毒颗粒。图：反转录病毒的生命周期2.反转录病毒载体 (1)辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体(2)不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载(3)广寄主的反转录病毒载体(4)反转录病毒表达载体 6三、痘苗病毒载体 痘苗病毒(Vaccinia virus)具有双链 DNA 基因组，同天花的病原体天花病毒(Variola virus)的亲缘关系十分密切。当人们接
16、种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在 DNA重组技术发展之后不久，就有人将外源 DNA 片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。(1)痘苗病毒的特性 痘苗病毒是在细胞质中进行复制和转录的的，因此自身需要编码为这些表达活性所需要的全部蛋白酶。由于痘苗病毒拥有广泛的寄主范围，而且其基因组至少能够容纳 25kb 大小的外源 DNA 片段的插入，具有相当大的克隆能力。这些优点，又使痘苗病毒具备了发展作为动物基因克隆载体的良好的条件。然而由于痘苗病毒基因组 DNA 是
17、非感染性的，故不能直接用于感染寄主细胞。(2)痘苗病毒载体的构建痘苗病毒载体 pGS20 为例，首先将编码着 tk 基因的痘苗病毒基因组 DNA 之 Hind III-J 片段，克隆到大肠杆菌质粒载体 pBR328 分子上；然后再把含有另一种痘苗病毒基因的启动子(p7.5)和转录起点的 275bpDNA 区段，插入到 tk 基因序列中间，于是便构成了痘苗病毒质粒载体 pGS20 应用 pGS20 痘苗病毒质粒载体，已成功地在猿猴细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，和流感病毒血细胞凝集素(IHA)等多种蛋白质。疫苗病毒载体 pGS20 图四、乳头瘤病毒载体 乳头瘤病毒(Papilloma
18、viruses)能够感染包括人类在内的多种脊椎动物，产生上皮肿瘤。但是只有完全分化的扁平的上皮细胞(epitelial cell)，才能产生感染性的乳头瘤病毒，迄今为止还没有办法在培养的细胞中增殖这种病毒。它能以多拷贝的染色体外双链 DNA 形式在哺乳动物细胞中培养维持很多代。构建穿梭载体策略：一、将编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因删除。二、将剩下的病毒基因组克隆到大肠杆菌质粒中，就够建成了穿梭载体。它在大肠杆菌中以质粒形式存在，而在人类细胞中以既不能整合到宿主 DNA 中，又不能产生病毒粒子裂解宿主的染色体外DNA 形式存在7五、腺病毒载体 腺病毒（adenovirus）属腺病毒科，腺病毒科
19、分为两个属，哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。腺病毒是一类无囊膜的 20 面体病毒，直径 70-90 纳米，其中 20 面体的每个顶角有一条纤维突起。由于人腺病毒具有易感性、宿主范围广、毒性低、使用安全、可容纳大的外源 DNA 片段，以及外源 DNA 片段不会整合到宿主染色体上等特性，因此人的腺病毒克隆载体成为基因转移中最有前途的克隆载体之一。腺病毒载体的构建首先：构建一个含有部分腺病毒基因组的质粒（ ） ，在其中的腺病毒基因中插入外源基因或用外源基因取代其中的一个片断；另外，构建一个含有腺病毒基因组其它部分的质粒（） ；两个质粒的腺病毒基因组有部分重合，这两种质粒都可以在大肠杆菌中扩增，然后共转
20、染宿主细胞，两种质粒中腺病毒基因组部分重合处发生同源重组，形成完整的病毒基因组。第三节 外源 DNA 导入动物细胞的方法 哺乳动物细胞很难捕获和表达外源的 DNA。下面是六种病毒载体以外的最常用最有效的用于哺乳动物基因转移的技术手段。包括如下：(i)磷酸钙转染技术；(ii)DEAE-葡聚糖转染技术；(iii)显微注射技术；(iv) 电穿孔技术；(v)原生质体融合技术。 一、磷酸钙转染技术 磷酸钙转染的基本步骤将待转染的外源 DNA 同 CaCl2 混合制成 CaCl2-DNA 溶液；在不断搅拌过程中，逐滴缓缓地加入到 Hepes-磷酸钙溶液中去，形成一种磷酸钙-DNA 共沉淀；然后用吸管仔细转
21、移共沉淀物，使之粘附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞所捕获。保温几小时后，将细胞洗净，并更换新鲜的培养液，继续培养至最终实现外源 DNA 的高水平表达。 图二 .DEAE-葡聚糖转染技术 二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称 DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的 DNA，实现瞬时的有效表达(1)DEAE-葡聚糖转染的一般程序8DEAE-葡聚糖转染主要有两种不同的方式。一种方式是先使病毒的 DNA 直接同 DEAE-葡聚糖混合，形成了 DNA/DEAE 葡聚糖复合物后，再用来处理受体细胞；另一种是受
22、体细胞先用 DEAE-葡聚糖溶液作预处理，然后再用来与转染的 DNA 接触。在这两种转染方式中，受体细胞在用 DNA 或 DNA/DEAE 葡聚糖复合物处理前，都要先用等渗溶液漂洗，除去培养液中的血清成分。(2)DEAE-葡聚糖转染的可能机理及影响因素关于 DEAE-葡聚糖促使哺乳动物细胞捕获外源 DNA 的分子机理，一种认为 DEAE-葡聚糖同 DNA 结合成复合物，可以保护 DNA 免受核酸酶的降解作用；另一种则认为 DEAE-葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使 DNA 能够容易地穿过细胞表面而进入细胞内部。影响 DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数量、DNA 的浓度和 DEAE
23、-葡聚糖的浓度最为重要。 大体说来，按每个直径 10cm 的培养皿中加入 1 10ug 的转染 DNA，并使用每毫升培养基含 100 400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都能得到很好的转染效率。由于 DEAE-葡聚糖对有些细胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反应可能较为合适。三.基因显微注射技术 应用玻璃显微注射器，可以把重组 DNA 直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。通常根据 DNA 注射的不同方式，可以把显微注射分为：（1）真正的显微注射(true microinjection)法，DNA 是由注射针直接注入细胞。（2） “穿刺”(pricking)导
24、入法，DNA 是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生长的单层细胞。四、电穿孔 DNA 转移技术电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或 DEAE-葡聚糖法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等优点。1）基本原理
25、在高压电场的作用下，细胞膜因发生临时性破裂所形成的微孔，足以使大分子以及像ATP 这样的小分子从外界进入细胞内部，或是反向流出细胞。细胞膜上微孔的关闭是一种天然衰减的过程，在 0下，这种过程会被延缓进行。在微孔开启期间，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。具有游离末端的线性 DNA 分子，易于发生重组，因而更容易整合到寄主染色体，形成永久性的转化子。超盘旋的 DNA 比较容易被包装进染色质，因此一般说来它对于瞬时基因表9达的实验更为有效。（2）操作程序将盛有细胞和 DNA 混合液的特制小容器置于电泳冲仪的正负电极间，在 0 下加高压(2.04.0kV)电脉冲 10 分钟后
26、，将处理的细胞转移到新鲜培养基生长 2 天，再行筛选。电穿孔之前若用秋水仙酞胺预处理细胞 10 小时，可提高转化效率 310 倍。(3)影响因素脉冲的最大电压和脉冲持续的时间，是影响电穿孔转染效率的两个主要因素，而与 DNA浓度则无多大关系。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为 10-410-5 之间。五、脂质体载体法脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡(lipid vesicles)，外周是脂双层，内部是水腔。用它作载体可以把外源 DNA 导入培养的哺乳动物细胞。这种由脂质体介导的使外源 DNA 导入细胞的方法
27、，叫做脂质体载体法，又叫做脂质转染法(lipofection)。脂质体结构图接(1)脂质体的制备制备脂质体的方法主要有如下两种。头一种是将适宜的脂质悬浮在液体介质中，然后迅速地振荡，使之形成大小相当一致的脂质体；另一种是用小型的注射针头，将脂质注射到酒精水溶液中，并快速混匀。(2)脂质转染法第一种常用的脂质转染法是，将外源 DNA 与阳离子型的脂质体混合形成 DNA-脂质复合物。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的高频率转移，故这种方法又叫做 DNA-脂质复合物转染法。在这个过程中，DNA 并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。第二种常用的脂质转染法叫
28、做脂质体载体法。它是将外源 DNA 包装在脂质体的内部，然后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源 DNA 进入细胞质，尔后再进入细胞脂质体载体法转移基因的基本步骤(3)脂质体载体法的优越性10制备程序比较简单， ，用它包装的 DNA 在 4下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容量大、可保护 DNA 免受核酸酶的降解作用等等。除此之外，脂质体法可以用来将外源的蛋白质导入受体细胞，为在活细胞内研究蛋白质的功能提供有用的途径。 七 .哺乳动物细胞基因打靶 基因打靶(gene targeting)技术，通过在转染细胞中发生的外源打靶基因与核基因组目标基因之间的 DNA 同源重组(ho
29、mologous recombination)，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。基因打靶的分子基础是，两条具有同样或类似核苷酸序列的同源 DNA 分子之间发生的遗传信息的重组事件。这也就是说，基因打靶的一个基本条件是，在外源打靶基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的 DNA 序列。基因打靶的基本过程 1.首先是将外源打靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的 DNA 片段，克隆在具有选择性标记基因(例如 neo)的载体分子上，构成专用的基因打靶载体；选用适当的核酸内切限制酶切割基因打靶载体，使之线性化后再用来转化受体
30、细胞。由于外源打靶基因的两侧，与内源核基因组上的目标基因或座位之间存在着同源的 DNA 序列，因此当线性化的载体 DNA 被导入受体细胞之后，两者便会彼此配对；此时在重组酶的作用下，两条同源 DNA 的相同部位便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现外源基因在核基因组 DNA 上的定点整合。第四节 转基因动物的获得获得转基因动物的实验操作：将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白
31、的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。一、反转录病毒法利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中；此方法是基因整合的最有效的方法。缺陷：反转录病毒载体容量小，转入的基因容易缺少邻近的调控序列。辅助病毒基因组可能与目的基因一起整合到同一细胞核中。二、DNA 微注射法首先，向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，增加受精卵数量。待雌鼠交配后取出受精卵，注射外源基因。 （在精前核时注射）11将注射过的受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内。待孕鼠产下幼鼠。对转基因动物进行检测。对操作者的技术要求较高需要转入的外源基因能够高效表达外源基因上含有能够提高整合效率的序列三、胚胎干细胞方法四、转基因鼠的应用1. 人类疾病的转基因模型2. 利用转基因鼠进行基因敲除试验3. 利用转基因鼠克隆在发育中起重要作用的基因4. 利用转基因鼠研究细胞的功能5. 利用转基因鼠作为外源基因的表达系统1. 什么是转基因动物？ 2. 显微注射法制备转基因动物的主要过程是什么？123. 外源基因导入动物细胞都有哪些方法？4. 转基因动物有哪些应用？思考：谈谈你对转基因动物的安全性问题的认识。
