1、生物化学实验指导适用专业:农学、植物保护、园艺、农产品质量与安全、中草药栽培与鉴定贵州大学农学院生化与分子生物学教研室2007 年 8 月目 录生物化学实验室规则1实验记录及实验报告2实验一 植物DNA的提取与测定3实验二 蛋白质的两性性质及等电点测定.7实验三 温度、pH 及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 9实验四 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.12实验五 糖的颜色反应和定性鉴定.14实验六 双缩脲法测定蛋白质含量.19附录21附录 1 生物化学实验基本操作 21附录2 实验样品的制备.25附录3 常用试剂的配制.26附录4 市售常用酸、碱的浓度.26附录5 一般化学试剂的
2、分级.27附录6 易变质及需特殊方法保存的试剂.27附录7 标准缓冲液的配制.28附录8 常用缓冲液的配制方法.29附录9 干燥剂.36附录10 硫酸铵饱和度的常用表37附录11 离心机转数(r/min)与相对离心力(RCF)的换算381生物化学实验室规则1每个同学都应该自觉遵守课堂纪律,维护课堂秩序,不迟到,不早退,不大声谈笑。2实验前必须认真预习,熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤,懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法,否则不能开始实验。3实验过程中要听从教师的指导,严肃认真地按操作规程进行实验,并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上,文字要简练、准确。完成实验后经教师检
3、查同意,方可离开实验室。4实验台面应随时保持整洁,仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后,应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕,仪器洗净放好,将实验台面抹拭干净,才能离开实验室。5使用仪器、药品、试剂和各物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时,应小心仔细,防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时,应严格遵守操作规程,发现故障须立即报告教师,不得擅自动手检修。6实验室内严禁吸烟!加热用的电炉应随用随关,严格做到:人在炉火在,人走炉火关。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热,并要远离火源操作和放置。实验完毕,应立即拨去电炉开关和关好水笼头,拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查水
4、电,严防发生安全事故。7废液体可倒入水槽内,同时放水冲走。强酸、强碱溶液必须先用水稀释。废纸屑及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内;不能倒入水槽或到处乱扔。8要精心使用和爱护仪器,如使用分光光度计时,不能将比色杯直接置于分光光度计上,并注意拿放比色杯时,不要打碎。仪器损坏时,应如实向教师报告,并填写损坏仪器登记表,然后补领。9实验室内一切物品,未经本室负责教师批准,严禁带出室外,借物必须办理登记手续。10每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作。2实验记录及实验报告每次实验要做到课前认真预习,实验操作中仔细观察并如实记录实验现象与数
5、据,课后及时完成实验报告。一、课前预习实验课前要将实验名称、目的和要求、实验内容与原理、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本中,做到心中有数。二、实验记录从实验课开始就要培养严谨科学作风,养成良好习惯。实验条件下观察到的现象应仔细地记录下来,实验中观测的每个结果和数据都应及时如实地直接记在记录本上,记录时必须使用钢笔或圆珠笔,并做到原始记录准确、简练、详尽、清楚。如称量试材样品的重量、滴定管的读数、分光光度计的读数等,都应设计一定的表格准确记下正确的读数,并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如,光密度值为0.050,不应写成0.05。每一个结果至少要重复观测两次以上,当符合实验要求并确知仪器
6、工作正常后再写在记录本上。另外,实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等,都应记录清楚,以便总结实验完成报告时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等,都必须重做实验。三、实验报告实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。按照实验内容可分为定性和定量两大类,实验报告的格式:实验序号,实验名称;(1)目的和要求(2)内容与原理(3)主要仪器及试剂配制(4)操作方法与实验步骤(5)结果与讨论定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在完成实验报告时,可以按照实验内容分别写原理、操作
7、方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法(或步骤)可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。定量实验报告中,目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述,但是对于实验条件(试剂配制及仪器)和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分,应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比,并尽量总结成各种图表,如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外,还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括:关于实验方
8、法(或操作技术)和有关实验的一些问题,如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等。3实验一 植物 DNA 的提取与测定一、目的本实验目的是学习从植物材料中提取和测定 DNA 的原理和方法,进一步了解 DNA 的性质。二、原理细胞中的 DNA 绝大多数以 DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取 DNA 时,一般先破碎细胞释放出 DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把 DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以 NaCl 溶液为
9、例:RNP 在0.14mol/L NaCl 中溶解度很大,而 DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的 1。当 NaCl 浓度逐渐增大时,RNP 的溶解度变化不大,而 DNP 的溶解则随之不断增加。当 NaCl 浓度大于 1mol/L 时,DNP 的溶解度最大,为纯水中溶解度的 2 倍,因此通常可用 1.4mol/L NaCl 提取 DNA。为了得到纯的 DNA 制品,可用适量的 RNase 处理提取液,以降解 DNA 中搀杂的 RNA。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。不同 DNA
10、 的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据 DNA 分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物,其荧光强度与 DNA 的含量成正比。据此可粗略估计样品 DNA 浓度。关于植物总 DNA 的提取主要有两种方法:1 CTAB 法:CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide,
11、简称 CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。2 SDS 法:利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称 SDS)使 DNA 与蛋白质分离,在高温(5565)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用
12、提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。一般生物体的基因组 DNA 为 107109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子 DNA 的分子量为克隆片段长度的 4 倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子 DNA 的方法必须考虑两个原则:(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等) 、多糖等杂质,并防止和抑制内源 DNase 对 DNA 的降解。 (2)尽量减少对溶液中 DNA
13、的机械剪切破坏。几乎所有的 DNase 都需要 Mg2+或 Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如 EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴) 。为实现(2)需要在DNA 处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行 DNA 溶液转移时用大口(或剪口)吸管。提取的 DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、 “熔点” (melting temperature, Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用 CTAB 法提取 DNA 并通过紫外吸收法鉴定。三、实验材料、主要
14、仪器和试剂1实验材料新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等2主要仪器(1)高速冷冻离心机 (2)751 型分光光度计 (3)恒温水浴(3)液氮或冰浴设备 (4)磨口锥形瓶 (5)电泳仪,电泳槽 (6)紫外透射检测仪 3试剂(CTAB 法)(1)CTAB 提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ,20 mmol/L EDTA-Na 2,1.4mol/L NaCl(如表 1) ,2% CTAB,使用前加入 0.1%(V/V)的 -巯基乙醇。表 1 CTAB 提取缓冲液配制4用 HCl 调pH 值。(2)TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM ED
15、TA( pH8.0) 。(3)DNase-free RNase A: 溶解 RNase A 于 TE 缓冲液中,浓度为 10mg/ml,煮沸 1030min, 除去 DNase活性,20贮存(DNase 为 DNA 酶,RNase 为 RNA 酶) 。(4)氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V):240ml 氯仿(A.R.)加 10mL 异戊醇(A.R.)混匀。(5)3mol/L 乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取 NaAc3H2O 81.62g,用蒸馏水溶解,配制成 200ml,用 HAc调 pH 至 6.5。(6)无水乙醇(7) Tris-硼酸(5TBE):54g Tris, 27.5
16、硼酸,20mol/L EDTA,配制成 1000ml(8)6X 载样缓冲液:0.25%溴酚蓝 ,0.25%二甲苯青 ,40%蔗糖水溶液(9)溴化乙锭(EB)TE 缓冲液,Tris-HCl(pH8.0)液,NaAc 溶液均需要高压灭菌。四、操作步骤(1) DNA 抽提1称取 25g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料,用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面,用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成 1cm 长,置研钵中,经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后,加入 15mL 预热(6065)的 CTAB 提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,置于 65水浴保温,0.51h,不时地轻轻摇动混匀。2加等体积的氯仿/异
17、戊醇(24:1),盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。3将锥形瓶中的液体转移到离心管中,在室温下 4 000 r/min 离心 5min,静置,离心管中出现 3 层,小心地吸取含有核酸的上清到另一干净的离心管中 (注意吸取上清时不能吸入界面物质),弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。4根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。5在抽提后的上清液中加入 1/10 倍体积的 3 mol/L NaAc(pH6.8)和 2 倍体积的 95乙醇,混匀,室温放置 5 min,以 10 000 r/min 离心 5min,倾去乙醇液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干液体。6加入 1 ml 70乙醇洗涤
18、 DNA 沉淀,按步骤 5 所述方法弃上清,于空气中或用电吹冷风使 DNA 沉淀干燥。7用适量含 RNase A 酶(20 g/ml)的 TE 溶解 DNA。(2) DNA 含量及纯度测定1吸取 5 l DNA 样品,加水至 1 ml,混匀后转入石英比色杯中。2分光光度计先用 1 ml 蒸馏水校正零点。3在 260 nm 紫外光波长下读出光密度值,代入下式计算 DNA 的含量。4测 OD260/ OD280值,DNA 纯品的 OD260/ OD280值为 1.8。如果 OD260/ OD280值大于 1.8,说明存在 RNA,可以考虑用 RNA 酶处理样品;小于 1.6,说明样品中存在蛋白质,
19、应再用酚/氯仿抽提以及氯仿单独抽提,之后用乙醇沉淀纯化 DNA。(3)琼脂糖凝胶电泳分离 DNA1 1g 琼脂糖加入 100ml 1TBE 电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 (冷却到 60,加入 100l 的 0.5mg/ml EB,并摇匀。 )2 用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖(约 50)倒入,室温冷却凝固。3 充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加 1TBE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。4 用移液器吸取总 DNA 或质粒样品 4l 于封口膜上,再加入 2l 的 6X 载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。 5
20、 打开电源开关,调节电压至 3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约 30min-60min。6 将凝胶放入 EB 染液中染色 5-10min,用清水稍微漂洗。 7 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光的 DNA 条带。五、结果计算OD260DNA 浓度(g/ml)0.020L稀释倍数试剂名称 M.W. 配制 1 000ml 配制 500mlTris 121.14 12.114 g 6.057 gEDTA-Na2 372.24 7.4448 g 3.7224 gNaCl 58.44 81.816 g 40.908 g5式中 OD260
21、为 260 nm 处的光密度;L 为比色杯光径(cm) ;0.020 为 1 g/ml DNA 钠盐的光密度。六、附注如果植物样品不经液氮处理,提取液中的 CTAB 浓度需要提高到 4%(W/V) 。在许多情况下,使用0.1%(V/V)巯基乙醇,并不能完全抑制叶片中的氧化作用,但是,这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于 0.1%(V/V) ,则会大大降低 DNA 的得率。七、思考题1制备的 DNA 在什么溶液中较稳定?2为了保证植物 DNA 的完整性,在吸取样品、抽提过程中应注意什么?八、注意事项1EB 是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。2实验过程中操作要
22、保持安静、镇定,注意样品不能混样。实验二 蛋白质的两性性质及等电点测定一、目的 (1)通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。(2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除 N 端 氨基与 C 端 羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团,它们都能解离为带电基团。因此,在蛋白质溶液中存在着下列平衡:调节溶液的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时,蛋白质溶解度最小,溶液的混浊度最大,配制不同 pH
23、的缓冲液,观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。三、仪器和试剂 1仪器试管架;试管:15ml6;刻度吸管:1ml4,2ml4,10ml2;胶头吸管2。2试剂(1) 1mol/L 乙酸:吸取 99.5%乙酸(比重 1.05)2.875ml,加水至 50ml。(2) 0.1mol/L 乙酸:吸取 1mol/L 乙酸 5ml,加水至 50ml。(3) 0.01mol/L 乙酸:吸取 0.1mol/L 乙酸 5ml,加水至 50ml。(4) 0.2mol/LNaOH:称取 NaOH2.000g,加水至 50ml,配成 1mol/LNaOH。然后量取 1mol/L NaOH 10ml
24、,加水至 50ml,配成 0.2mol/L NaOH。(5) 0.2mol/L 盐酸:吸取 37.2%(比重 1.19)盐酸 4.17ml,加水至 50ml,配成 1mol/L 盐酸。然后吸取1mol/L 盐酸 10ml,加水至 50ml,配成 0.2mol/L 盐酸。(6) 0.01%溴甲酚绿指示剂:称取溴甲酚绿 0.005g,加 0.29ml 1mol/L NaOH,然后加水至 50ml。(7) 0.5%酪蛋白溶液:称取酪蛋白(干酪素)0.25g 放入 50ml 容量瓶中,加入约 20ml 水,再准确加入1mol/L NaOH 5ml,当酪蛋白溶解后,准确加入 1mol/L 乙酸 5ml,
25、最后加水稀释定容至 50ml,充分摇匀。四、操作方法 蛋白质分子阴离子 两性离子 阳离子pH pI pH = pI pH pI电场中: 移向阳极 不移动 移向阴极61蛋白质的两性反应(1)取一支试管,加 0.5%酪蛋白 1ml,再加溴甲酚绿指示剂 4 滴,摇匀。此时溶液呈蓝色,无沉淀生成。(2)用胶头吸管慢慢加入 0.2 mol/L 盐酸,边加边摇至有大量沉淀生成。此时溶液的 pH 值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。(3)继续滴加 0.2 mol/L 盐酸,沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。(4)滴加 0.2mol/L NaOH 进行中和,沉淀又出现,继续滴加 0.2 m
26、ol/L NaOH,沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。解释以上(1)(4)的颜色及沉淀变化的原因。 注:溴甲酚绿的变化范围2. 酪蛋白等电点的测定(1)取同样规格的试管 7 支,按下表精确地加入下列试剂:管 号试剂(ml)1 2 3 4 5 6 71.0mol/L 乙酸 1.6 0.8 0 0 0 0 00.1mol/L 乙酸 0 0 4 1 0 0 00.01mol/L 乙酸 0 0 0 0 2.5 1.25 0.62蒸馏水 2.4 3.2 0 3 1.5 2.75 3.38溶液的 pH 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9(2)充分摇匀,然后向以上各试管依次加入 0.5
27、%酪蛋白 1ml,边加边摇,摇匀后静置 5 min,观察各管的混浊度。(3)用-、+、+、+等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点,最混浊一管的 pH 值即为酪蛋白的等电点。五、注意事项 缓冲液的 pH 值必须准确。六、思考题1解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2该方法测定蛋白质等电点的原理是什么?实验三 温度、pH 及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、目的 1. 巩固温度、pH 值、激活剂、抑制剂对酶活性影响的认识。2. 学习测定酶的最适温度、最适 pH 值的简单方法,学习检测激活剂和抑制剂的方法。二、原理 酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。在一定条件下,酶促化学反
28、应进行的能力即称为酶活性(酶活力) 。影响酶活性的因素是多方面的,如温度、pH 及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下,能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度,而能使酶活性达到最高时的 pH 即酶的最适 pH。例如,唾液淀粉酶的最适温度是 37,而其最适 pH 是 6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂,能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。唾液中含有唾液淀粉酶,淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长
29、而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色,而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈现颜色反应,如图所示:淀粉 糊精 麦芽糖+少量葡萄糖三、仪器和试剂 淀粉酶 淀粉酶(棕黄色,碘本身颜色)(紫红色、暗褐色或红色等)(蓝色)加碘后:71仪器试管 (10 mm100 mm);试管架;电热恒温水浴箱;沸水浴;冰浴;多孔白瓷板 (或比色盘);滴管2试剂(1) 0.5%淀粉溶液:称取可溶性淀粉 0.5 g 加蒸馏水少许搅拌成糊状,然后用煮沸的 1%氯化钠溶液稀释到100 ml。(2) 碘化钾碘溶液:取碘化钾 2 g 及碘 1.27
30、g 溶解于 200 ml 蒸馏水中,使用前用蒸馏水稀释 5 倍。(3) 1%淀粉溶液:称取可溶性淀粉 1.0 g 加蒸馏水 100 ml,煮沸溶解。(4) 1%CuSO4溶液:称取 1 g CuSO45H2O,用蒸馏水溶解至 100 ml。(5) 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 pH5.08.0A0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液:称 25.62 g Na2HPO42H2O,用蒸馏水溶解后,定容至 1000 ml;B0.1 mol/L 柠檬酸溶液:称 19.21 g 无水柠檬酸,用蒸馏水溶解后定容至 1000 ml。用 A、B 两种溶液,按附录方法,配制 pH5.0、pH6.8、pH8.0 各 10
31、ml。(6) 0.5%NaCl 溶液。(7) 唾液淀粉酶制备:每人用自来水漱口 3 次,然后取 20 ml 蒸馏水含于口中,半分钟后吐入烧杯中,稀释至 40 ml 为稀释唾液,供实验用。四、操作方法 (一) 温度对酶活性的影响1取 3 支大试管,编号后按下表操作试 管 号 0.5%淀粉溶液 稀释唾液 1 温 度1 5 ml 1 ml 0水浴2 5 ml 1 ml 37水浴3 5 ml 1 ml 沸水浴2在白色比色盘上,置碘液 2 滴于各孔中,自试管放入水浴后,每隔 1 min,从第二管中取反应液 1 滴与碘液混合,观察颜色变化。3待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化 (即只呈碘的颜色)时,向各管
32、中加入碘液 1 滴,摇匀,观察并记录各管颜色,说明温度对酶活性的影响。(二) pH 对酶活性的影响 21取试管 3 支,按下表操作试管号 0.5%淀粉溶液 pH5.0 缓冲液 pH6.8 缓冲液 pH8.0 缓冲液 稀释唾液1 2 ml 3 ml 0 0 1 ml2 2 ml 0 3 ml 0 1 ml3 2 ml 0 0 3 ml 1 ml2将 3 支试管放入 37水浴中,并在白色比色盘上用碘液检查第二管,待碘液不变色时,向各管加碘液几滴,观察并记录各管颜色。(三) 酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响1取小试管 3 支,按下表操作试管号 1%淀粉溶液 1%CuSO4溶液 3 0.5%NaCl溶
33、液 4 蒸馏水 稀释唾液1 2 ml 1 ml 0 0 1 ml2 2 ml 0 1 ml 0 1 ml3 2 ml 0 0 1 ml 1 ml2将 3 支试管放入 37水浴中,并在白色比色盘上用碘液检查第二管,待碘液不变色时,向各管加碘液1 滴,观察水解情况,记录并解释结果。注:1 稀释唾液加入时应迅速,其中加入沸水浴的一管,当唾液加入后应立即放入沸水浴。2 酶的最适 pH 受缓冲液性质的影响。如唾液淀粉酶的最适 pH 为 6.8,但在磷酸缓冲液中,其最适 pH 为8COHOHNO2O2N3,5-COHOHNH2O2N 3-5-+ +6.46.6,在醋酸缓冲液中则为 5.6。3 CuSO4溶
34、液为唾液淀粉酶的抑制剂。4 NaCl 溶液为唾液淀粉酶的激活剂。激活剂和抑制剂不是绝对的,有些物质在低浓度时为激活剂,而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如,氯化钠到 1/3 饱和度时就抑制唾液淀粉酶的活性。实验四 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖
35、和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计) 。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在 540 nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉;精密 pH 试纸。2 主要仪器(1)具塞玻璃刻度试管:20 ml1
36、1 (2)大离心管:50 ml2 (3)烧杯:100 ml1(4)三角瓶:100 ml1 (5)容量瓶:100 ml3 (6)刻度吸管:1 ml1;2 ml2;10 ml1(7)恒温水浴锅 (8)沸水浴 (9)离心机 (10)扭力天平 (11)分光光度计3 试剂(1)1 mg/ml 葡萄糖标准液准确称取 80烘至恒重的分析纯葡萄糖 100 mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到 100 ml 容量瓶中,用蒸馏水定容至 100 ml,混匀,4冰箱中保存备用。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将 6.3 g DNS 和 262 ml 2M NaOH 溶液,加到 500 ml 含有 1
37、85 g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5 g 结晶酚和 5 g 亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至 1000 ml,贮于棕色瓶中备用。(3)碘-碘化钾溶液:称取 5 g 碘和 10 g 碘化钾,溶于 100 ml 蒸馏水中。(4)酚酞指示剂:称取 0.1 g 酚酞,溶于 250 ml 70%乙醇中。(5)6 M HCl 和 6 M NaOH 各 100 ml。四、操作步骤1 制作葡萄糖标准曲线取 7 支 20 ml 具塞刻度试管编号,按表 4.1 分别加入浓度为 1 mg/ml 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表 4.1 葡萄糖
38、标准曲线制作管 号 1mg/ml 葡萄糖标准液(ml) 蒸馏水(ml) DNS(ml) 葡萄糖含量 (mg) 光密度值(OD540nm)0 0 2 1.5 0 91 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀,在沸水浴中准确加热 5 min,取出,冷却至室温,用蒸馏水定容至 20 ml,加塞后颠倒混匀,在分光光度计上进行比色。调波长 540 nm,用 0 号管调零点,测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡
39、萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。2 样品中还原糖和总糖的测定(1)还原糖的提取准确称取 3.00 g 食用面粉,放入 100 ml 烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入 50 ml 蒸馏水,搅匀,置于 50恒温水浴中保温 20 min,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到 50 ml 离心管中,于 4 000 r/min 下离心 5 min,沉淀可用 20 ml 蒸馏水洗一次,再离心,将二次离心的上清液收集在 100 ml 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。(2)总糖的水解和提取准确称取 1.00 g 食用面粉,放入 100 ml 三角瓶中,加 15
40、 ml 蒸馏水及 10 ml 6M HCl,置沸水浴中加热水解 30 min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查) 。待三角瓶中的水解液冷却后,加入 1 滴酚酞指示剂,用 6 mol/L NaOH 中和至微红色,用蒸馏水定容在 100 ml 容量瓶中,混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液 10 ml,移入另一 100 ml 容量瓶中定容,混匀,作为总糖待测液。(3)显色和比色取 4 支 20 ml 具塞刻度试管,编号,按表 2 所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表 4.2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液(ml)总糖
41、待测液(ml)蒸馏水(ml)DNS(ml)光密度值(OD 540nm)查曲线葡萄糖量(mg)7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。提取液总体积查曲线所得葡萄糖毫克数测定时取用体积 还原糖(%)=样品毫克数 100六、附注1 离心时对称位置的离心管必须配平。2 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色,并使用同一空白调零点和比色。3 面粉中还原糖含量较少,计算总糖时可将其合并入
42、多糖一起考虑。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2如何正确绘制和使用标准曲线?查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数总糖(%)=样品毫克数 0.910010实验五 糖的颜色反应和定性鉴定一、目的(1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、糖的颜色反应. Molish 反应-萘酚反应1 实验原理糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与 -萘酚作用形成紫红色复合物,在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环,因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外,各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性
43、反应。因此,阴性反应证明没有糖类物质的存在;而阳性反应,则说明有糖存在的可能性,需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。2 试剂Molish 试剂:取 5 g -萘酚用 95%乙醇溶解至 100 ml,临用前配制,棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。3 操作方法取试管,编号,分别加入各待测糖溶液 1 m,然后加两滴 Molish 试剂,摇匀。倾斜试管,沿管壁小心加入约 1 ml 浓硫酸,切勿摇动,小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液,重复一遍,观察结果。. 蒽酮反应1 实验原理糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10-酮-9,10-二氢
44、蒽)作用生成蓝绿色复合物。2 试剂蒽酮试剂:取 0.2 g 蒽酮溶于 100 m 浓硫酸中,当日配制。待测糖溶液,同 Molish 试验。3 操作方法取试管,编号,均加入 1 ml 蒽酮溶液,再向各管滴加 2 3 滴待测糖溶液,充分混匀,观察各管颜色变化并记录。. 酮糖的 Seliwanoff 反应1 实验原理该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛,它与间苯二酚作用生成鲜红色复合物,反应仅需 20-30 秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸,才产生微弱的阳性反应。2 试剂Seliwanoff 试剂:0.5 g 间苯二酚溶于 1 升盐酸(H 2OHCl=21)(V/V)
45、 中,临用前配制。111%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%果糖溶液。3 操作方法取试管,编号,各加入 Seliwanoff 试剂 1 ml,再依次分别加入待测糖溶液各 4 滴,混匀,同时放入沸水浴中,比较各管颜色的变化过程。. Fehling (菲林) 试验1 实验原理菲林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热,则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在,则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀,Fehlingv 试剂中加入酒石酸钾钠,它与 Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子,该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一
46、定浓度的氢氧化铜。菲林试剂是一种弱的氧化剂,它不与酮和芳香醛发生反应。2 试剂试剂甲:称取 34.5 g 硫酸铜溶于 500 ml 蒸馏水中。试剂乙:称取 125 g NaOH、137 g 酒石酸钾钠溶于 500 ml 蒸馏水中,贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前,将试剂甲和试剂乙等量混合。1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。3 操作方法取试管,编号,各加入 Fehling 试剂甲和乙 1 ml。摇匀后,分别加入 4 滴待测糖溶液,置沸水浴中加热 2 3 min,取出冷却,观察沉淀和颜色变化。. Benedict 试验1 实验原理Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Ben
47、edict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂,其碱性较 Fehling 试剂弱,灵敏度高,干扰因素少。2 试剂Benedict 试剂:将 170 g 柠檬酸钠和 100 g 无水碳酸钠溶于 800 ml 水中;另将 17 g 硫酸铜溶于 100 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠碳酸钠溶液中,边加边搅,最后定容至 1000 ml。 该试剂可长期使用。1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。3 操作方法取试管,编号,分别加入 2 ml Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液,沸水浴中加热 5 分钟,取出后冷却,观察各管中的颜色变化。. Barfoed (巴弗) 试验1 实验原理
48、在酸性溶液中,单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed 试剂为弱酸性,单糖在 Barfoed 试剂的作用下能将 Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜,时间约为 3 分钟,而还原二糖则需 20 分钟左右。所以,该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长,非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。2 试剂Barfoed 试剂:16.7 g 乙酸铜溶于近 200 ml 水中,加 1.5 ml 冰醋酸,定容至 250 ml 即可。1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。3 操作方法取试管,编号,分别加入 2 ml Barfoed 试剂和 2 3 滴待测糖溶液,煮沸 2-3 分钟,放置 20 分钟以上,比较各管的颜色变化。三、注意事项(1) Molish 反应非常灵敏,0.001葡萄糖和 0.0001蔗糖即能呈现阳性反应。因此,不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时,由于浓硫酸对它的焦化作用,将呈现红色及褐色而不呈紫色,需稀释后再做。(2) 果糖与 Seliwanoff 试剂反应非常迅速,呈鲜红色,而葡萄糖所需时间较长,且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与 Seliwanoff 试剂反应,戊糖经酸脱水生成糠醛,与间苯二酚缩合,生成绿色至蓝色产物。(3) 酮基本身没有还原性,只有在变成烯醇式后,才显示还原作用。1