1、FDNB法测定氨基酸含量,主讲教师: 王英武 电 话: 5619955 电子信箱: ,实验目的,熟悉色谱仪器的组成及原理 了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以C18为例) 定量分析的方法(外标法) 梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法),色谱仪器的组成及原理I,HPLC组成脱气系统(在线与离线) 氦气脱气 真空脱气 超声脱气 流动相传输系统(色谱泵)一元 二元 三元 四元 多元 评价指标:压力限制, 流速范围及精度 冲程大小等 进样系统(手动与自动进样器) 评价指标:精度 重现性 死体积 速度 可控性 (温度及各种其他功能),色谱仪器的组成及原理II,色谱分离的原理,色谱分离的基本
2、原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离 分离方式多种多样,min,0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,mAU,0,20,40,60,80,1.939,分流对紫外检测的影响,流速对保留时间及峰面积的影响,有机相比例对出峰时间和峰面积的影响,HPLC条件的优化,洗脱方式 一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快 但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。,梯度洗脱,HPLC条件的优化,柱温对色谱行为的影响 依那普利,色谱柱,色谱柱的规格 填料 颗粒粒径孔径 厂
3、商 流动相组成 洗脱方式 柱温 检测方式及具体条件 流动相的组成对分离度的影响 流速对色谱行为的影响 柱温对色谱行为的影响 溶剂对色谱的影响 pH值 离子强度 缓冲液 离子对等其他因素的影响,定量分析的方法(外标法),定量分析的方法(内标法),氨基酸衍生化实验(FDNB法),FDNB法的原理 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）,1仪器： 四元泵 waters；柱温箱 无；紫外可变双
4、波长检测器 2487;手动进样器;Millennia 工作站 色谱柱：Zorbax Exclipse XDB 1504.6 mm 5 mm,一 仪器与试剂,仪器与试剂,保护柱： XDB C18 4.6x12.5mmGuard fitting Kit 化学试剂：氨基酸标样 250，500，1000 pmol/mL 1% FDBN（大连化物所可购）磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾，乙腈，重蒸水 辅助品： 2 mL棕色小瓶，pH试纸，恒温水浴箱，溶剂过滤器，样品过滤器，可变量程微量移液器(10-00 mL)。,二 实验步骤,衍生化： 于2 mL棕色瓶里精确加入30 mL 不同浓度的 AA标样 ，30
5、mL 0.5 NNaHCO3 (pH=9)和 1% FDBN 10 mL，于 60C暗处加热 60 min。放置 室温，加 1 mL （ 0.01 N, pH=7.0） KH2PO4，摇匀，待HPLC分析。 HPLC 条件： 流动相 A ：0.04 N KH2PO4 pH=7.2 流动相B ：乙腈/水=55/45 (v/v) 梯度：B：14% 4 min-10 min/40%-20 min/80%-21 min,100%, 流速：1 mL/min 检测波长：360 nm ； 柱温：40C； 进样量：10 mL,二 实验步骤,根据得到的数据，求算未知样品浓度 完成实验报告 思考题 为什么要保持反应溶液的碱性环境 为什么要对氨基酸进行衍生化处理 保护柱的作用是什么 反相色谱分离的原理是什么 实验中有哪些注意事项,实验结果,
