1、环孢素 A 微球抑制兔后囊膜混浊的安全有效剂量【摘要】目的:研究环孢素 A 微球(CsAMS) 抑制兔眼晶体后囊膜混浊的安全有效浓度.方法：将 16 只兔眼随机分为高、中、低浓度组和空白对照组，高、中、低 组含 CsA 浓度分别为：3,2,1g/L.均行囊外晶体摘除+ 人工晶体植入术,术毕实验组囊袋内注入含不同浓度CsAMS 的混 悬液 0.1mL，对照组注入 0.1mL 混悬液含空白微球(MS)0.2mg，术后按时检查前房反应并测量眼压和房水 CsA 浓度.2mo后摘取术眼行角膜及后囊膜组织病理学及电镜形态学检查.结果：术后第 1wk 房水中 CsA 浓度开始增高，2wk 时达到高峰，以后缓
2、慢释放，持续作用 1mo 余；裂隙灯观察实验高、中、低浓度组均可抑制后囊膜混浊，与对照组有统计学差异（P0.05）；组织病理学和电镜观察，实验组晶体上皮细胞的增殖均不同程度受到抑制，呈浓度依赖型，高浓度组抑制后囊膜混浊作用最强，但对角膜内皮细胞有损害，中浓度组和低浓度组对组织无明显毒性.结论：CsAMS 浓度 l，2g/L 在实验期内是抑制兔眼后囊膜混浊的安全有效剂量. 【关键词】环孢素 A 微球；后囊混浊；兔眼；有效剂量 0 引言 晶状体后囊膜混浊，亦称后发性白内障（posteriarcapsuleopacification,PCO），为白内障摘除 术后最常见的并发症，其发病机制主要是术后残
3、留在晶状体前囊膜下和赤道部的晶体上皮细胞的增殖、移行和化生1-2.环孢素 A（CsA）在眼科近年来发现其除了具有免疫抑制效应外，还具有抗增殖作用，体外实验可有效抑制晶体上皮细胞增殖.我们利用聚乳糖酸(polymerpolylactioglycolicacid,PLGA)为载体,携带 CsA 制成 CsA 缓释微球(CsAMS) ，应用于兔眼晶体摘除术后，观察 CsAMS 抑制后囊膜混浊的安全有效剂量，为临床应用提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 16 只健康新西兰白兔，体质量 1.52.0kg，1012wk ，雌雄兼用(西安交通大学医学院实验动物中心提供) ；眼科手术显微镜（T4 型
4、苏州六六公司），普通光学显微镜（日本日立公司）；电子显微镜（H600 型日本日立公司）；裂隙灯（苏州六六公司）；眼压计（X80型日本 Topcon 公司）； EP 人工晶体（美国 AMO 公司）；30g/L 羟丙甲基纤维素粘弹剂（天津晶明公司）；高效液相色谱仪(美国WatersAlliance 公司)；环孢素 A 微球(CsAMS) 由环孢霉素 A 与乳酸羟基乙酸共聚物制成(由中国医学科学院生物医学研究所提供). 1.2 方法 1.2.1 环孢素微球(CsAMS) 的制备采用乳化溶剂挥发/ 萃取法制取.微球平均粒径为 63.22m，跨距为 1.57，载药量为 7.50%，包封率为37.50%.
5、30g/L 羟丙甲基纤维素作为混悬介质，制成不同药物浓度的混悬液，实验组每 0.1mL 混悬介质中的 CsAMS 含药量为: 高浓度组0.3mg,中浓度组 0.2mg,低浓度组 0.1mg,对照 组每 0.1mL 混悬介质含空白微球(MS)0.2mg. 1.2.2 动物分组及手术实验动物分 4 组，每组 8 只眼，分别为高、中、低浓度组和对照组.盐酸氯胺酮和盐酸氯丙嗪肌肉注射麻醉，开睑器开睑，3.2mm 穿刺刀作 1112 点钟透明角膜切口，2 点位作辅助切口，注入透明质酸钠,做连续环行撕囊,囊口 34mm 直径大小，水分离，娩出晶体核，吸出囊袋内残余皮质.注入甲基纤维素，扩大切口，囊袋内植入
6、人工晶体.将含不同浓度药物及对照物的混悬液 0.1mL 注入囊袋内,结膜下注射庆大霉素 1 万 U 及地塞米松 2mg,用 10g/L 阿托品眼膏涂眼.所有操作由术者一人完成. 1.2.3 术后检查术后 114d，1mo，2mo 进行眼部裂隙灯检查及眼压测量，后囊膜混浊分级按 Odrich 分级标准3，第 1,2,4,8 周麻醉后前房穿刺抽取 0.2mL 房水，放射免疫法检测房水 CsA 浓度. 1.2.4 组织病理学检查术后 8wk 空气栓塞处死动物，完整取出晶状体囊袋放入 40g/L 甲醛 溶液中固定，按常 规 HE 染色后,于光镜下观察晶状体后囊情况. 1.2.5 电镜检查术后 8wk
7、将兔眼晶状体后囊膜及角膜取出后立即放入 4的 25g/L 戊二醛溶液中固定,按常规方法制作电镜标本,锇酸染色,透射电镜检查. 统计学处理：计量数据以 xs 表示，应用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，组间比较采用重复测量方差分析，等级资料用非参数秩和检验，以 P0.05 为有 统计学意义. 2 结果 2.1 眼的前房反应术后 15d 各组都有不同程度的结膜充血，角膜水肿，前房出现纤维渗出，710d 后症状消退，4 组间比较无明显差异，术后各期均未见虹膜新生血管、萎缩或坏死等表现. 2.2 眼压变化术后第 1 日各组眼压与术前及术后第 3，7 日有统计学差异（P0.05 ），组间同期比
8、 较无统计学差异.3d 以后眼压稳定，同期各组比较亦无差异（P 0.05，表 1）.表 1 各组术后眼压值 2.3 眼房水 CsA 浓度三组术后第 1 周 CsA 浓度均逐渐增高，2wk时达到最高峰，以后逐渐下降，8wk 时近乎 检测不出(图 1). 图 1 术后不同时间房水 CsA 浓度 2.4 后囊膜混浊情况术后第 8 周裂隙灯显微镜检查各组后囊膜混浊程度，按 Odrich 分级标准，高浓度组 0 级 7 眼，1 级 1 眼；中浓度组 0级 5 眼，1 级 3 眼；低浓度组 0 级 3 眼，1 级 4 眼，2 级 1 眼；对照组 0级 2 眼，1 级 2 眼， 2 级 4 眼.高、中、低
9、浓度组与对照组比较差别有统计学意义（P0.05），高 浓度组与低浓度组间比较差别亦有统计学意义（P0.05 ）. 2.5 组织病理学后囊膜经 HE 染色，可见术 后 8wk 高浓度组后囊膜光滑，无上皮细胞增殖（图 2A）.中浓度组亦无明 显增殖（图 2B）；低浓度组可见上皮细胞轻微增殖（图 2C）；对照组有不同程度的增生，梭形细胞排列成宽的束状，细胞间可见胶原化，局部形成 Elschnig 小体（图 2D）. A：高浓度组；B：中浓度组；C：低浓度组；D：对照组. 图 2 眼后囊膜变化 HE400 2.6 电镜形态学观察透射电镜观察中、低浓度组角膜内皮细胞形态规则、大小均匀，表面有微绒毛，无明
10、 显损害；高浓度组表现为内皮细胞肿胀，细胞与基膜连接疏松，细胞膜结构不完整.观察晶体后囊膜显示高浓度组上皮细胞体积明显缩小，核内染色质凝集，细胞内空泡增加，线粒体肿胀明显（图 3A）；中、低浓度组 上皮细胞形态不规则，电子密度较高，线粒体轻度肿胀，细胞间连接减少，间隙增宽（图3B，C）；对照组晶体上皮 细胞排列整齐，核仁，染色 质及高尔基体等细胞器未见异常（图 3D）. 3 讨论 PCO 的预防已成为 世界范围内的研究课题，药物防治 PCO 应具备：有效抑制晶体上皮细胞的增殖和移行；对眼内其他组织无毒性作用；适合注入前房，有效药物浓度能够维持足够长的时间4.环孢素A（CsA）为高效免疫抑制剂.
11、近年发现 CSA 具有抑制晶状体上皮细胞增生的作用3.可能机制为抑制细胞因子 IL1，IL6 的分泌或阻断细胞因子的作用而抑制晶体上皮细胞增殖5，从而预防 PCO. 乳酸 羟基乙酸共聚物（PLGA）微球用于制备生物降解型缓释体系是目前国内外研究的热点.该微球体系能够控制微球大小、延长药物释放时间等.通过改变共聚物配比的组成，可调节聚合物在体内生物降解速率6.PLGA 在体内最 终被完全降解 为 CO2 和 H2O 排出体外，故人体对聚合物耐受性大、生物兼容性好. A：高浓度组；B：中浓度组；C：低浓度组；D：对照组. 图 3 眼后囊膜变化10000 本研究以 PLGA 为载 体将 CsA 制成
12、微球注入兔眼晶体囊袋内，观察不同浓度 CsAMS 对晶体上皮细胞的抑制程度及对眼内组织的毒性作用，筛选在眼前节的安全有效浓度.裂隙灯显微镜、组织病理学观察晶体后囊膜混浊，均显示实验组与对照组有统计学差别（P0.05），高、中、低浓度组均可抑制后囊膜混浊的发生.高浓度组对眼前节结构影响较大，术后前房反应明显比其它组重，持续时间长，电镜显示对角膜内皮亦有损伤，表现为内皮细胞肿胀，细胞与基膜连接疏松，细胞膜结构不完整.中、低浓度组和对照组电镜显示角膜内皮细胞无明显损害.眼压测量显示 CsAMS 对眼压无影响.房水 CsA 浓度测量，第 2 周各组浓度最高，随后几周缓慢释放，呈持续作用，1mo 后药物
13、浓度几乎消失.实验结果提示术后炎症反应期内，眼内 CsAMS 持续释放，有效抑制晶体上皮细胞增殖，高浓度损伤角膜内皮，中、低浓度对眼内组织无明显毒性.但 CsAMS 是否能长期抑制晶体上皮细胞增殖仍有待研究. 综上所述，1， 2g/LCsAMS 组在实验期内能预防 PCO 的发生，满足药物防治 PCO 所应 具备的条件， 为临床应用提供了实验依据，有望成为临床预防 PCO 的一条新的局部用药途径. 【参考文献】 1SchmidbauerJM,VargasLG,PengQ,etal.PosteriorcapsuleopacificationJ.IntOphthClin,2001,41(3):10
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