1、黑色素浓 集激素受体 2 基因 siRNA 重组腺病毒载体构建及鉴定【摘要】 目的: 构建黑色素 浓集激素受体 2（MCHR2）siRNA 重组 腺病毒载体,并在稳定表达 MCHR2 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中鉴定其干 扰作用. 方法： 人工合成靶向 MCHR2 的siRNA 干扰 序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体 pSES HUS上，得到 pSES HUS MCHR2siRNA，并与腺病毒骨架质粒 pAdeasy 1在 BJ5183 细 菌中进行同源重 组，得到pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA，在 HEK293 细胞中包装成重组腺病毒，感染稳定表达 MCHR2 的
2、 CHO 细胞株, RT PCR及 Western Blot 检测腺病毒 对细胞 MCHR2 表达的影响. 结果： 成功构建MCHR2siRNA 重组腺病毒载体. MCHR2siRNA 重组腺病毒显著抑制 CHO 细胞中 MCHR2 的表达. 结论： 构建的 Adeasy MCHR2 siRNA 腺病毒能有效地抑制 CHO 细胞中 MCHR2 表达，为研究MCHR2 的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具. 【关键词】 腺病毒载 黑色素浓集激素受体 RNA 干扰0 引言黑色素浓集激素（MCH）是中枢作用的一种神经肽，可以调节进食、能量代谢及情绪变化. David 等1发现 MCH 的受体 MC
3、HR2 可能是引起儿童肥胖的候选基因之一. RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是双链 RNA 介导的、序列特异的转录后基因沉默(PTGS)现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染， 维持基因组中转座子的稳定性，清除异常 RNA，并参与基因表达的调控. 我们研究小组已经筛选出了针对 MCHR2 的有效的干扰序列，我们用该序列构建针对 MCHR2 基因重组 腺病毒干扰载体，在稳定表达 MCHR2 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中 检测干扰效果，为研究肥胖机制及其基因治疗提供新思路及新工具.1 材料和方法1.1 材料针对 MCHR2 基因的干扰序列1：5 AAGACGGTGTTG
4、AGAGTTGTTTT 3;序列 2： 3 TTTTCT GCCACAACTCTCAACAA 5. 大肠埃希菌 DH5，HEK293 细胞，pSES HUS，pAdeasy 1,稳定表达 MCHR2 的 CHO 细胞(重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室)；限制性内切酶Sfi，Kpn ，EcoR和 T4 DNA 连接酶(TaKaRa 公司)；限制性内切酶 PacI 和 PmeI(New England Biolab 公司)；质粒提取试剂盒（美国Omega 生物技术公司）；凝胶回收 试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；DMEM 培养基(Gibico 公司)；胎牛血清( 杭州四季青公司)；Li
5、po fectamineTM2000（Invitrogen 公司）；RT PCR 试剂盒(TOYOBO 公司)和 TRIZOL 试剂( 北京鼎国生物技术有限责任公司)；膜蛋白提取试剂盒（凯基生物发展有限公司）；MCHR2 多克隆抗体、兔抗人 actin多克隆抗体(Santa Cruz 公司 )和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德公司)；所需引物均由上海生工合成.1.2 方法1.2.1pSES HUS MCHR2siRNA载体的构建用 Sfi酶切pSES HUS质粒，胶回收酶切片段. 将靶向 MCHR2 的干扰序列退火成为双链 DNA 片段，克隆到 酶切后的 pSES HUS质粒中，
6、胶回收 连接产物，转化 DH5菌，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用 Kpn， EcoR双酶切鉴定正确后送上海生工 测序，获得含小干扰 RNA(siRNA)表达框的腺病毒穿梭 质粒pSES HUS MCHR2siRNA，其图谱如图 1. 图 1pSES-HUS-MCHR2siRNA 图谱（略）1.2.2pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA，pAdeasy SES HUS载体的构建用 CaCl2 法将 pAdeasy 1转化到 BJ5183 感受态细菌中，pSES HUS MCHR2siRNA，pSES HUS质粒用 Pme酶切线性化，CaCl2 法转化到 BJ ea
7、sy感受态细菌卡那霉素及链霉素抗性培养基筛选阳性克隆，提取质粒用 Pac酶切鉴定 质粒并转化 DH5感受态细胞中保存.1.2.3 重组腺病毒的包装与病毒滴度测定包装细胞培养：含100 mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养基，37，50 mL/L CO2 培养箱中培养 HEK293 细胞，当细胞汇合度达 7080 时转染；重组腺病毒载体转染 HEK293 细胞：重组质粒pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA，pAdeasy SES HUS用 Pac酶切后回收，按照 Lipo fectamineTM2000说明书转染 25 mL 瓶中的HEK293 细胞，1012 d 后收集细胞，-
8、80与 37反复冻融 3 次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染 HEK293 细胞使病毒大量扩增重复上述步骤，最终收集 3 轮扩增的病毒液，分装保存于-80 ；病毒滴度的测定：参照 Kaneto 等2的 GFP 阳性细胞计数法计数细胞的红色荧光.1.2.4RT PCR检测 CHO 细胞 MCHR2 转录水平的变化重组腺病毒感染 CHO 细胞 48 h 后，提取实验组和对照组细胞总 RNA，紫外分光光度计测定总 RNA 浓度，按照 TOYOBO 说明书进行 cDNA 第1 链的合成，以反转录得到的 cDNA 为模板 进行 PCR 反应. MCHR2上下游引物分别是p1：5 TGCAATCCCAG
9、TGTACCAAA 3，p2：5 CCCACATAGAAGGCCAGTGT 3，反应产物长度为 152 bp；内参照 actin上下游引物分别是p1：5 ACGAGACCACCTTCAACTCCATC 3，p2：5 TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA 3，扩增片段大小为 304 bp. 反应条件为：94预变性 2 min，再 9415 s55 15 s72 20 s，共 30 个循环，最后 72延伸 5 min. 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，比较干扰组与对照组 mRNA 水平表达差异.1.2.5Western Blot 检测重组腺病毒对 MCHR2 蛋白表达的影响在重组腺病毒感
10、染 CHO 细胞 48 h 后提取 细胞膜蛋白进行 Western Blot 检测. 每孔上样 30 g，蛋白样品经 SDS PAGE分离后，电转移到 PVDF 膜上依次加入 50 g/L 脱脂奶粉( 室温封闭 1 h)，1200 MCHR2 抗体(4孵育过夜)，12000 的 HRP 酶标兔抗羊二抗(室温孵育 2 h)TBST 缓冲液洗涤，加入化学发光剂显影.2 结果2.1pSES HUS MCHR2siRNA载体的 鉴定 Kpn，EcoR双酶切鉴定 6 个克隆，进行琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆载体只被 Kpn单酶切，pSES HUS 被切成 6790 bp 和 1798 bp 片段（图 2），
11、与实验设计相符. 2 泳道的质粒测序鉴定结果正确. M：D15000 marker； 16：pSES HUS MCHR2siRNA； 7：pSES HUS.图 2 穿梭载体酶切鉴定（略）2.2pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA，pAdeasy SES HUS载体构建 pSES HUS MCHR2siRNA,pSES HUS质粒用 Pme酶切后与 pAdeasy 1在细菌 BJ5183 内进行同源重组. 得到pAdeasy SES HUS MCHR2 siRNA，pAdeasy SES HUS载体，Pac酶切鉴 定正确(图 3). 证明骨架载体同源重组成功.M：DNA/Hind
12、 marker； 1：pAdeasy； 2：pAdeasy SES HUS； 3：pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA； 4：Pac酶切 pAdeasy SES HUS； 5：Pac酶切 pAdeasy SES HUS MCHR2siRNA.图 3Pac酶切重组腺病毒载体（略）2.3 重组Adeasy SES HUS MCHR2siRNA，Adeasy SES HUS腺病毒的包装重组腺病毒质粒载体转染包装细胞 HEK293,第 2 日在倒置荧光显微镜下可见少量红色荧光. 1 wk 后可见大约 40的红色荧光. 第 12日，可见大部分包装细胞肿胀脱落，荧光显微镜观察视野满布红色荧
13、光（图 4），表明重组腺病毒构建成功. 重组腺病毒滴度：Adeasy SES HUS MCHR2 siRNA 为6.51011pfu/L，Adeasy SES HUS为 5.41011pfu/L.图 4 腺病毒表达的红色荧光蛋白10 （略）2.4 稳定表达 MCHR2 的 CHO 细胞中 MCHR2 基因表达包装完成的病毒颗粒以 3107pfu 总量感染 50 mL 培养瓶的 CHO 细胞，48 h 后收集细胞总 RNA 及膜蛋白，检测其变化 . RT PCR结果表明，干扰组与对照组细胞相比，MCHR2 基因 mRNA 量明显降低（图 5)；Western Blot 结果显示，干扰组的 MCH
14、R2 蛋白表达量 显著减少（图 6).M：marker； 1： 对照组 MCHR2 ； 2：干扰组 MCHR2； 3，4：对照组与干扰组 actin.图 5 对照组与干扰组 RT PCR结果（略）1：干扰组； 2：对照组.图 6 对照组与干扰组 Western Blot 结果（略）3 讨论MCH 是新近发现的一种下丘脑神经肽，由 19 个氨基酸组成,可以调节进食、能量代谢及情绪. 啮齿类动物中枢急性给予 MCH 会刺激进食，长期给予将引起肥胖及高胰岛素血症. 过表达 MCH 的小鼠摄食增多，轻度肥胖，并出现高血糖和胰岛素抵抗. 相反，缺乏 MCH的小鼠（MCH 敲除小鼠）摄食减少，瘦弱，代谢增
15、高. 因此 MCH 与肥胖的关系非常密切3.目前已经克隆出两种 MCH 受体：MCHR1 和 MCHR2. MCHR1与 MCHR2 分别由 353 和 340 个氨基酸残基组成，都是有 7 个跨膜 螺旋的 G 蛋白偶联受体超家族（GPCRs）I 类成员. MCHR1 主要分布于大脑皮质、海马、丘脑、中 脑、脑桥及下丘脑的腹内侧核、背内侧核和弓状核，它可在啮齿类及多种高等动物体内表达. MCHR2 可分布于大脑皮质、海马、下丘脑，它不能在 啮齿动物体内表达，目前发现MCHR2 只在人、恒河猴、犬、野猪、白鼬中有表达4-5 . 两种受体的分布区域都与摄食中枢、能量代谢及情绪调节有关. 动物模型证
16、实MCHR1 与肥胖、焦虑及抑郁密切相关. MCHR1 基因敲除的小鼠瘦弱，活动增加. 另外， 这些受体敲除小鼠摄食增加，代谢改变，并对饮食所至的肥胖有抵制作用6. 目前国内外关于 MCHR2 的研究进展十分缓慢，它与肥胖的关系也未研究清楚. 我们成功构建了MCHR2siRNA 腺病毒，可以用于以后的动物 实验，进而对 MCHR2的功能及它和肥胖的关系进行深入研究.在本实验中，我们采用 He 等7创建的 pAdeasy 腺病毒载体系统，通过细菌体内同源重组的方法，构建针对 MCHR2 基因的 siRNA重组腺病毒载体该方法不但发挥了重组腺病毒高效、安全等优点，同时，还具有重组效率高、包装时间短
17、等特点腺病毒载体介导的RNA 干扰克服了以往用 质粒作为 siRNA 输 送载体转染效率低的缺陷. 实验中我们使用 RT PCR，Western Blot 的方法在 mRNA 水平和蛋白质水平证实针对 MCHR2 基因的 siRNA 重组腺病毒有效地抑制了MCHR2 基因的表达. 表明腺病毒是一种有应用前景的研究功能未知基因 MCHR2 工具. Adeasy SES HUS MCHR2 siRNA 还可用于动物实验，为研究 MCHR2 与肥胖的关系提供了新思路.【参考文献】1 David M, Cecile L, Jerome D, et al. A Genome Wide Scan for
18、Childhood Obesity Associated Traits in French Families Shows Significant Linkage on Chromosome 6q22.31-q23.2 J. Diabetes, 2004,53: 803-811.2 Kaneto H, Xu G, Song KH, et al. Activation of the Hexosamine Pathway Leads to Deterioration of Pancreatic Cell Function through the Induction of Oxidative Stre
19、ss J.J Biol Chem,2001,276(33):31099-31104.3 Gabriella S L, Richard L, Bradley EK, et al. Melanin concentrating hormone is a critical mediator of the leptin deficient phenotypeJ. PNAS, 2003, 100:10085-10090.4 Suke W, Jiang B, Kim O, et al. Identification and Pharmacological Characterization of a Nove
20、l Human Melanin concentrating Hormone Receptor, MCH R2J. J Biol Chem, 2001, 276(37): 34664-34670.5 Songzhu A, Gene C, Jack JZ, et al. Identification and characterization of a melanin concentrating hormone receptorJ. PNAS, 2001, 98(13):7576-7581.6 Donald JM, Drew TW. Melanin concentrating hormone 1 receptor deficient mice are lean, hyperactive, and hyperphagic and have altered metabolismJ. PNAS, 2002, 99:3240-3245.7 He TC，Zhou S，Costa LT，et a1A simplified system for generating recombinant adenoviruses JPNAS,1998, 95(5)：2509 2514.
