1、抑制性消减杂交(SSH)技术服务 1996年,Diatchenko 等人发明了 SSH 技术。该方法运用杂交二级动力学原理(即丰度高的单链 DNA 在退火时产生同源杂交的速度比丰度低的单链 DNA 更快) ,使在丰度上有差别的单链 DNA 相对含量基本相等。抑制 PCR 则是利用链内退火优于链间退火的特性,使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发夹的互补结构,从而无法做为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。兼并了消减杂交技术的消减富集和抑制 PCR 技术进行了高效率的动力学富集的特点:该技术的应用: 比较两个 mRNA 群体,并获得只在一个群体中过量表达或特异性表达的
2、某个基因的 cDNA。我公司采用 Clontech 公司 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 构建差减文库,已完成数十个 SSH 文库的构建(包括植物组织、动物组织、临床样本、微生物等各个种属) ,积累了丰富的操作经验。欢迎各位老师来电来函,让我们共同学习、共同探讨,为您的研究提供优质的平台服务!SSH 即抑制消减杂交技术是由 Diatchenko 等于1996 年以 m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制 PCR , 并结合标准化(normalization 或 equalization ) 和消减杂交(
3、 substractive hybridization)。抑制 PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板, 使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列, PCR 中不能扩增, 从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群中 cDNA 的丰度, 即低丰度差异表达的基因不会丢失, 而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群( tester) 与驱赶基因群(driver) 间的同源序列。存在于 tester 中而不存在于 driver 中, 或在 tester 中较在 driver 中有高水平表达。 第一
4、次差减杂交 ,用过量的 drivercDNA 分别与 tester2adaptor1cDNA 和tester2adaptor2cD2NA 杂交。分别形成 SSH 技术原理图所示的 tester 单链片段 a、tester 双链片段 b、tester2driver 同源双链片段 c 和 driver 单、双链片段 d。根据杂交二级动力学,丰度较高的分子产生同源杂交体(homo2hy2brid)的速度较快,使高丰度与低丰度单链片段 a 浓度大致相等,从而实现 tester 单链片段 a 的标准化6, 并使连接一种接头的差异表达基因 a 初步富集。 第二次差减杂交,将上述分别与 drivercDNA
5、 杂交后的 tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA 混合,再加入新制备的变性 drivercDNA,因 tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA 同源,除形成 a、b、c、d 片段外,又形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段 e,即连接两种接头的差异表达序列 e,是进行 PCR 指数扩增的模板。PCR 之前填补分子粘性末端以利于退火。第一轮 PCR,加入针对 adaptor1和 adaptor2外侧序列的特异引物进行扩增。结果:a、d 片段因没有引物结合位点,不能进行 PCR 扩增;b 片段由于两端均为同一接头,具有反向末端重复序列
6、(invertedre2peats),在单链内部形成互补发卡结构的可能性及稳定性均大于引物与其配对结合的可能性及稳定性,故在 PCR 反应中不能扩增;c 片段的一端为一种接头而另一端无接头,只能线形扩增;只有 e 片段末端有两种不同接头,可通过 PCR 作指数扩增。第二次 PCR,加入一对与接头内侧序列相同的巢式 PCR 特异引物,进一步富集差异表达序列并降低背景。经过两轮 PCR,基于 PCR 抑制效应的存在,以及选用了两对引物,可以特异扩增代表了差异表达的 cDNA 片段。经上述 PCR 所得的差别表达基因片段可以利用接头上存在的酶切位点,插入适当载体,转化细菌。经 X2Gal 蓝白菌落初
7、步筛选,获得具有差异表达 cDNA 片段的阳性克隆。然后通过 Northern 杂交鉴定,cDNA 序列分析,可获得一些新的 ESTs 序列,如进一步对该 ESTs 进行深入的结构和功能研究,可望获得新的具有重要生物学作用的全长功能基因。甲基化是在 DNA 甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在 CpG 二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA 甲基化是表观遗传修饰的主要方式,它不改变 DNA 的一级结构,却在细胞的发育、基因的表达、及基因
8、组的稳定性中起着重要的作用。CpG 岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象,而启动子 CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此,基因启动子甲基化检测在临床诊断(如 p16甲基化检测与低剂量 CT 等相结合) 、药物敏感性实验等(如靶向药物)等方面具有很高的应用价值。目前甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法MSP 法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR
9、)扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互补的 DNA 序列的甲基化状态。MSP 法灵敏度较高,应用范围广。MSP 实验流程:难点: 实验流程长,操作烦琐,不易控制; 实验操作要求熟练而精细:若起始 DNA 量太多,则修饰不完全;若量太少,则在修饰、回收过程中易丢失。 修饰过程,需保证 pH 值准确,所有试剂要求新鲜配置,需要摸索最适反应时间。 需对 PCR 引物设计、退火温度选择、 Taq 酶及 Buffer 的选择配置进行优化。MSP 法中,影响因素较多。对实验试剂、实验经验和实验习惯都有较高的要求。我公司凭借多年分子生物学实验经验,搭建了稳定的技术平台,积累了数百例MSP 成功经验
10、,已经在临床检验方面与多家医院建立了稳定的合作关系!miRNA and siRNA PathwaysmiRNAs are first transcribed in the nucleus as long primary miRNAs(pri-miRNA). While still in the nucleus, they are processed into precursor miRNAs (pre-miRNA) by nuclear Drosha, a dsRNA-specific ribonuclease. Pre-miRNAs are subsequently transported
11、from the nucleus into the cytosol by Exportin-5. Dicer (an RNase III-like enzyme) processes the pre-miRNAs into 22 nt mature miRNAs that are subsequently incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC). When the RISC identifies the complementary or partially complementary mRNA target, it
12、inhibits gene expression by mRNA degradation or by translational repression.microRNA 检测:1、实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)Real-time PCR 技术于1996年由美国 Applied Biosystem 公司推出。该技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,与常规 PCR 相比,特异性更强,自动化程度更高,而且提供了针对 PCR 污染问题更有效的解决方案。现已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。已经或正广泛应用于分子生物学研究的各个领域,如:DNA 定量、RNA 定量、 SNP 分
13、析、基因型分析、 RNA 变异分析等。2、以 RT-PCR 方式从组织 /细胞中克隆目的基因3、5-RACE, 3-RACE我们在对基因序列进行分析时,一般通过 RT-PCR 扩增的目的片段,然后进行克隆。但一般的 RT-PCR 技术,很难从 mRNA 扩增得到某个基因的全长 cDNA 片段。cDNA 末端的快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)法能有效地解决这个问题。该技术基于 mRNA 反转录和 PCR 技术,用部分已知序列为起点,扩增未知序列,从而得到 cDNA 完整序列。应用: 从有限已知序列获得单个目的基因完整序列 从有限已知序列同时
14、获得一系列基因完整序列 获得未知完整序列:向未知序列中引入已知序列,然后进行 RACE4、基因定点突变5、单核苷酸多态性(SNP )检测单核苷酸多态(SNP )是指由单个核苷酸替代、插入或缺失形成的分子形态。有时也包括多个核苷酸插入或缺失造成的点突变。SNP 是人类基因组中数量最多的一种多态形式。人类基因组中总共有300万个 SNP,平均每1000个碱基中就有一个 SNP。其中相当多的 SNP 位点直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗能力有关。SNP 检测在临床及临床相关研究中已有广泛应用。我公司采用Taqman/MGB 探针法检测 SNP 位点。6、慢病毒/腺病毒/腺相关病毒包装及转染7、RNA 干扰您只需要提供目的基因的名称、种属等信息,我们为您完成如下实验过程: 干扰序列设计并合成 干扰载体构建 质粒载体大量置备 转染 干扰效果检测(RT-PCR、Western blotting)8、免疫印迹(Western blotting)