1、注：黄色标记为参考文献，红色为我觉得的一些要点。整理框架大致为：一、植物基因工程总述二、在农业方面的应用三、在药学方面的应用四、在花卉方面的应用五、环境保护方面的应用。六、DNA 条形码植物基因工程（植物基因工程技术及其进展 李瑞国）植物基因工程是近几年发展起来的分子生物技术。基因工程是按照人们的意愿,把一种生物的有用基因提取或合成出来,在生物体外对 DNA 分子进行剪切、拼接、修饰和重新组合,然后转移到受体细胞内进行组织培养和无性繁殖,在受体细胞内复制并得到表达,产生受体细胞新的遗传性状,产出人类所需的基因产物。利用植物基因工程技术,改良作物蛋白质成分,提高作物中必需的氨基酸含量,培育抗病毒
2、、抗虫害、抗除草剂、抗盐、抗旱等抗逆境植株,有的已建立了品系,为快速培育优质、高产的良种开辟一条全新途径,并展示了植物基因工程在未来农业生产中的诱人前景。1.目的基因的获取1.1 目的基因的分离直接分离是用在核苷酸序列中具有特定切点的 DNA 限制性内切酶将供体细胞中含目的基因的 DNA 片段切取分离出来。目前国际上已经分离出可供植物基因工程使用的不同目的基因有 100 多个。大部分是从植物细胞中分离出来的,例如从豆科植物的种子中分离得到多种种子贮藏蛋白基因,抗除草剂基因也是从植物中分离出来的;有的取自微生物和动物,如由苏云金芽孢杆菌中可得到抗虫基因,由病毒中得到抗病毒的基因。1.2 人工合成
3、基因目前人工合成基因的方法主要有:一是以目的基因转录成的 mRNA 为模板,反转录成互补的单链 DNA,然后在酶的催化下合成双链 DNA,而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的 mRNA 序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法以四种脱氧核苷酸(dNTA) 为原料合成目的基因。 三是通过 DNA 序列自动测序仪对提出的目的基因进行核苷酸序列分析,采用聚合酶链式反应(PCR)技术,快速、简便地扩增目的基因的 DNA 片段。其基本方法是:先提取植物的染色体DNA 或 RNA,对于 RNA,需经过逆转录酶合成第一链 cDNA
4、,然后以染色体 DNA或第一链 cDNA 为模板,以人工合成的一对寡聚核苷酸为引物,在 dNTP 存在下,通过 DNA 模板的变性、模板与引物的退火及引物的延伸 3 个阶段的多次循环,来扩增目的基因。2目的基因的修饰目的基因分离出来后往往需要经过一些修饰,让它们能够和更好的在转基因植物中进行表达。生物体细胞中存在着对基因表达的调控机制,使基因能够有序地表达。在基因 DNA 分子上有结构基因,在结构基因的上游有协调配合,共同对结构基因的表达起调控作用的操纵基因、启动子和调节基因。操纵基因起“开关”作用,直接控制结构基因的转录;启动子上有与 RNA 聚合酶结合的位点,RNA聚合酶在具有选择辨认和起
5、始转录作用的 因子帮助下与启动子结合并准确地识别转录起点并转录起始,在 RNA 聚合酶催化下合成 RNA,直到终止子为止,即转录出一条 RNA 链;调节基因能够调节和控制操纵基因的状态和作用。 目的基因的修饰就是在目的基因的 3端加上所需启动子,在 5端加上终止子,以便使该外源基因在受体细胞中有效地表达,充分发挥其功能1、2。启动子的作用部位及强弱直接关系到它所启动的基因在转基因植物中表达产物的出现部位以及出现数量的多少;启动子活动的 特异性及局限性决定了有些基因只在某一特定的植物组织器官中和特定的发育阶段进行活动和表达;有些启动子也受生理条件或外界的环境条件调控。因此,选用适当的启动子和修饰
6、原启动子为适宜的启动子是决定基因工程成败的关键。常用的称为 35S 启动子是从花椰菜花叶病毒(CaMV) 的基因组里分离出来的 ,目前它在植物中表达能力最强 ;Nos 启动子是从土壤农杆菌的 Ti 质粒的胭脂碱(Nopaline)合成酶的基因上分离出的,章鱼碱合成酶可分离出 Ocs 启动子,它们比 35S 弱一些,但它们具有真核生物启动子的一些特点,能在植物细胞中进行表达。此三种启动子都是组成型表达的启动子,具有非特异性。如果希望目的基因只在某一特定部位如植物根中表达,则应选取具有根部组织特异性表达的启动子。若想在马铃薯的块茎中得到大豆的贮藏蛋白,就应把大豆贮藏蛋白的基因先分离出来,把上面原有
7、的启动子切掉,换上一个在马铃薯的块茎中能活动的启动子,这样才能在转基因马铃薯的块茎中得到大豆的贮藏蛋白2。转录的终止似乎并不很重要,目前常用胭脂碱合成酶的 Nos 终止子。如今,人们认识到在构建植物表达基因时除必须考虑合适的启动子和终止子外,还必须考虑增强子、内含子、密码子偏爱性、加 poly A 信号序列、转录和翻译起始位点周围的结构、5和 3端非翻译序列等3 。3目的基因转移到植物受体细胞的方法3.1 植物基因工程运载体及与目的基因的结合植物基因工程实验常用土壤农杆菌 Ti 质粒作载体,需删除原 Ti 质粒上的致病基因并用抗生素抗性基因代之。已发展出了共整合型载体和双元载体两套载体系统。也
8、可用 DNA 病毒等材料构建载体。Ti 质粒是根癌农杆菌细胞核区外存在的一种双链 DNA 分子,其长度约 200-250kb,30以下稳定存在于农杆菌中。Ti 质粒有 4 个同源区,其中 T-DNA 区和 Vir 区与基因的转移和表达有关。T-DNA 能转移到植物受体细胞并整合到染色体基因组 ,称转移 DNA。常见的胭脂碱型根癌农杆菌中 T-DNA 区段为 24kb,T-DNA 两侧是 25bp 的直接重复序列,这个边界序列(尤其是右边界序列)是 T-DNA 转移所必需的 ,并有方向性,即必须是顺式才能实现 T-DNA 转移。任何放置在边界序列之间的 DNA 都将被转移到植物细胞中。Vir 区
9、段约 35kb,包含至少 6 个操纵子。该段是 T-DNA 转移所必需的,但无需与 T-DNA 直接相连。因此导致了双元载体的形成,即 Vir 区留在 Ti 质粒上,而 T-DNA 放在一个更小,能自行复制和易操作的质粒上4。目前,美国Monsanto 公司、英国 PBI(植物育种研究所)、美国 PGEL(植物基因工程实验室)和比利时 Gent 实验室等都有一批常用植物基因工程的载体,其中大部我国已有引进。运载体能够携带目的基因在侵染植物细胞时插入整合到受体细胞的基因组中并稳定地遗传给子细胞。将目的基因与运载体结合,实际上是不同来源的 DNA 重组过程。首先用一特定的限制性内切酶切断运载体产生
10、粘性末端,然后用同一种限制性内切酶切断目的基因,使其产生相同的粘性末端,由同一种限制性内切酶切断得到的两个DNA 片段的粘性末端可通过碱基互补配对而结合 ,并在 DNA 连接酶的催化作用下,DNA 链的 5磷酸基与一相邻的 DNA 链的 3羟基形成磷酸二酯键连接起来,形成重组 DNA 分子。3.2 DNA 直接转移法直接转移法是利用物理化学方法将外源基因直接转入受体植物细胞的技术。聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等尤其是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物,这些聚合物和二价阳离子如 Ca、Mg、Mn 及 DNA 可在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内吞作用而被吸收。电击法是将植物细胞
11、酶解去壁获得原生质体,并与外源基因混合置于电激仪的样品室中,在适当外电压作用下,进行短时间(s - ms)直流电脉冲,细胞膜被击穿而使外源基因导入原生质体内。基因枪法是将外源基因吸附在钨、金等金属微粒(1m)表面,然后以 400m/s 的速度直接射入受体植物细胞,微弹携带外源基因穿透细胞壁和细胞膜进入受体植物细胞而实现基因转移。此外,还有激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法和花粉管通道法等。3.3 不同转移方法的有关特性比较不同的转移方法能导入的外源 DNA 的大小不同。基因枪一次能导入多达12 个不同质粒,总长为 600kb 的 DNA;利用原生质体可导入长为 10kb 的 DNA;最近
12、研究表明,借助能增加 VirG 和 VirE 蛋白表达量的质粒和双元细菌人工染色体载体,农杆菌介导的转移体系能有效的将长达 150kb 外源 DNA 完整地导入植物的细胞核并稳定遗传。不同的基因转化方法对外源基因的整合及其引起的不同程度的基因重排和结构变异、稳定性及其遗传规律均有明显影响5。外源基因在植物基因组中整合的位点和一个整合位点的拷贝数都是随机的。农杆菌载体转化的外源基因整合位点较稳定,常在 T-DNA 25bp 处与植物 DNA 整合,大多数是单位点整合; 整合的外源 DNA 基本保持其结构的完整性,结构变化很少 ;整合外源基因的拷贝数常以单或低拷贝 T-DNA 为主 ,也有少量多拷
13、贝 T-DNA 以首尾串联形式在单位点整合;整合的外源基因在转基因植株的显性表达率较高 ;外源基因在转基因植株中的分离符合孟德尔的遗传规律,大多数的 F1 转基因植株以 31 分离。DNA 直接转化将裸露的 DNA 随机导入植物受体细胞,其有序性和计量性都较差。整合机制也尚未清楚,因此它与农杆菌载体转化相比,外源 DNA 整合位点较多,可以在一条染色体上或不同染色体上进行多位点整合;整合的外源 DNA 易发生结构变化和修饰,如 DNA 片段分离、丢失、环化、甲基化等;整合外源DNA 的拷贝数也较多,多拷贝的比例相对较高;整合外源 DNA 的遗传效应比较复杂,基因间的位置效应、共抑制现象等表现明
14、显; 整合外源 DNA 的遗传特性多,转基因植株的表型丰富,F1 植物的分离比例比较复杂 ,但也基本上符合孟德尔遗传规律,单位点的 31 分离比较少,其遗传稳定性与农杆菌转化相比,表型较差。但无论采用什么转化方法,一但供体 DNA 整合进宿主基因组,愈伤组织分化和减数分裂中能保持其遗传稳定性,转化的外源基因在细胞的生长周期中一般都能表达,但不同的转化方法表达水平有一定的差异。4植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养植物细胞经过目的基因转移处理后,只有少数细胞被转化,需将转化细胞与未转化细胞区分开来,并淘汰未转化的细胞,然后利用植物细胞的全能性在适当的环境条件下使转化细胞发育为转基因植株。
15、目前,转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因,即筛选标记基因和筛选试剂。就是将有抗性的筛选标记基因同时转移进植物细胞中去,然后在筛选试剂的作用下,未转化的细胞受到抑制,转化的细胞被赋予抗性而能继续存活、分裂和分化成株。为了实现有效的转化,必须依据转化材料和转移方法选择合适的抗性基因和筛选试剂2、3 。许多双子叶植物如烟草、番茄、辣椒、马铃薯等和一些单子叶植物采用常用的新酶素磷酸转移酶基因作为抗性筛选基因,转化细胞能抵抗筛选试剂卡那霉素(kanamycin),而未转化的植物细胞则在筛选试剂存在下死去。但在水稻的转化中,卡那酶素尽管能阻止原生质体的再生,可它
16、对未转化的愈伤组织的抑制作用却很弱,并会阻碍转化的愈伤组织再生植株,而利用抗生素G418 就可避免以上问题。植物细胞的全能性指植物细胞具有全套遗传信息,在特定的适当环境下仍能够进行表达,培养成为一个完整的植物体。目前目的基因载体转移的实施方法是叶盘法,是将植物的叶片或其他的一些组织切割成段、或切成 0.8-2.0cm2 的圆盘或方片,切割处即造成损伤口,将他们浸入土壤农杆菌培养液内几分钟,然后将组织表面多余的菌液吸去,把这些侵染过的组织放在合适的固体培养基的表面上培养,经过一段时间的培养后,在这些组织的伤口附近会出现许多愈伤组织。再经过诱导的方法,在愈伤组织中会分化出芽点,并长出有根有茎的植株
17、,最后将它们移植到土壤中去,此即为转基因植株。该培养方法也可用于悬浮培养细胞、茎切段、子叶切片、下胚轴切段等离体材料的转化。这种方法已在多种双子叶植物中使用。DNA 直接转移法是将 DNA 通过一定手段直接导入到植物的原生质里或细胞中去,然后将它们放在适当的培养基表面进行培养,使其形成愈伤组织,最后诱导出苗并培养成植株。5目的基因的表达和鉴定大多数转基因植物的外源基因的表达都相当低,现在认为这是由于外源基因插入的位点效应引起的;另外,外源基因的表达会受到植物体自身的同源基因或先前转入的外源基因中的同源序列的影响而常表现为外源基因失活。目的基因在其转化后获得的转基因植物中能否有效表达,转基因植物
18、能否表现出特定的遗传性状,并稳定地遗传给后代,可借助植株的表型、PCR 方法鉴定和筛选转化植株,或取植物细胞或愈伤组织的提取物检测外源基因表达的生成物来鉴定。目前有一类用来显示外源基因导入与否的基因称为报告基因。双子叶植物农杆菌转化中常用 Nos、Ocs 作为报告基因,另外常用的还有 CAT、GUS、绿色荧光蛋白基因等报告基因。它们都具有表达稳定和易检测的特点。外源基因被稳定转化的最直接的证据是检测到整合到植物基因组中的外源基因,且检测到它的表达,最好能进一步分析后代。植物基因工程的主要内容可以简要的归纳成以下几点：（1）从种类繁多的植物基因群体中分离出有用的目的基因（2）寻找或构建能够承受人
19、们感兴趣的外源基因的插入和进行遗传转化等特性的克隆（3）将重组的载体通过体外转化等方法导入植物受体细胞，并整合到寄主染色体的基因组上（4）将获得的带有外源目的基因之重组载体 DNA 的植物细胞或组织再生成形态正常的健康能育的植株（5）在理想情况下，使这些植物能够通过有性的过程，将外源目的基因持续的传递给后代。植物基因工程不断发展,目前已形成了一套较为成熟的植物基因转化技术,它构成了植物基因工程的研究内容,主要又包括了以下几个方面.1(1)目的基因的获取:供植物基因转化的基因可以来自植物本身,也可以来自微生物和动物,少数还可以人工合成,通常以来自植物本身为主.它有一些常见的技术: PCR 技术.
20、转座子示踪技术 .基因组相减技术.染色体步查技术.(2)目的基因的修饰.(3)目的基因转化到植物受体细胞的方法:将目的基因与运载体结合,实际上是不同来源的 DNA 重组过程.直接转移法.聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等尤其是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物.电击法、基因枪法等是常用的方法.此外,还有激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法等.(4)植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养: 目前,转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因,即筛选标记基因和筛选试剂.2为了实现有效的转化,必须依据转化材料和转移方法选择合适的抗性基因和筛选试剂.(5
21、)目的基因的表达和鉴定等.（ 植物基因工程的应用与展望 李红梅，王林，陈娟）农业（植物基因工程在农业上的应用 李文兰 秦新民）1发展现状自 1983 年世界上第一例转基因植物问世以来,植物基因工程研究进入了蓬勃发展阶段。全世界已分离目的基因几百个获得转基因植物近 200 种,已有几千例转基因植物被批准进入田间试验,涉及的植物有 50 多种1。1999 年有 12 个国家种植了商业化的转基因植物,种植面积 1996 年约 280 万 hm2,1997 年增加到1100 万 hm2,1999 年增加到 3990 万 hm2,比 1996 年增加了 14 倍。2000 年美国、阿根廷、加拿大和中国转
22、基因作物的种植面积占全球种植面积的 99.9%,是面积最大的前 4 个国家。现在转基因的试验和研究遍布全世界,转基因作物的种植面积在迅速增加,其产值也在逐年增加。统计到 1999 年初美国农业部批准进入商品化的转基因农作物有七大类几十种,FAD( 美国食品和药物管理局)确定 43 个转基因品种商品化。我国的农业基因工程研究于 80 年代初期开始启动,并于 80 年代中期开始将生物技术列入国家“863”高科技发展计划。据中国农业生物技术学会统计,截止 1996 年底,我国正在研究的转基因植物种类达 47 种,涉及各类基因 103 个。到 1999 年有 73 项转基因申请,批准环境释放 18 项
23、,中间试验 24 项,目前我国被批准进行商品化生产的转基因植物有 6 种,包括华中农业大学的转基因耐储藏的番茄,北京大学的转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄,中国农科院的抗虫棉花和美国孟山都公司的保龄棉。2在农业生产中的应用(抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆性、丰产优质、杂交育种、生物固氮、医药工厂化农业)2.1抗虫据不完全统计,全世界农作物每年因病虫害造成的损失约占其总产量的 37 %,其中 13 %是由虫害引起的。植物虫害使全世界每年大约损失数千亿美元,美国在小菜蛾的防治上所耗费用达 10 亿美元,作物产量损失为 4000 多万 T,我国因虫害每年造成田间作物减产水稻达 10%,小
24、麦近 20%,棉花则达 30%以上。目前,对农作物病虫害的防治主要依赖化学药物。化学药物对害虫的防治起到重要的作用,同时也有成本高、污染环境、易残留、会毒害有益的昆虫及害虫的天敌等弊端。基因工程的发展为培育抗病虫的作物提供了新的手段。利用基因工程手段培育抗病虫害作物品种可克服常规育种的不足:(1) 它不仅利用存在于植物中的抗病虫基因,还可以利用某些动物、微生物中的抗性基因,将其重组到植物染色体上,并使之在植物体内特定地遗传及表达,从而产生抗病虫害性状,因此基因资源非常丰富。(2) 培育出的抗病虫新品种可控制任何时期植物任何部位发生的病虫害。(3)育种周期短、成本低。(4) 利用基因工程培育抗病
25、虫作物品种还具有不污染环境及抗病虫物质不易被环境因素所破坏的优点。目前,人们已发现并分离到了许多有用的抗虫基因,有的抗虫基因已导入植物体内而获得了转基因抗虫植物,有的转基因抗虫作物进入了大田试验,展现出了美好的应用前景,转抗虫基因的烟草、棉花在一些国家已进入商品化生产。已克隆得到的抗虫基因根据它们的来源可分为三类:第一类是从细菌中分离出来的抗虫基因,主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因 ;第二类是从植物组织中分离出的抗虫基因,主要为蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集索基因等,其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTi); 第三类是从动物体内分离的毒素基因 ,主要有蝎毒素基
26、因和蜘蛛毒素基因等。1987 年比利时的 Vacek 研究小组、美国 Monsanto 公司 Fischhoff 等人报道了首例有关转 Bt 基因烟草和番茄的研究结果,此后 Bt 基因相继被转入到棉花、水稻、玉米、苹果和核桃等农作物中,是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。据粗略统计,目前已经有 60 多种 Bt 基因被报道。美国是育成世界上首例抗虫棉的国家,我国是继美国后育成抗虫转基因棉的第二个国家,育成的中国第一代单价抗虫棉,抗虫性 90%以上,减少用药 60%80%,增产 30%40%。1992 年底中国农科院生物技术研究中心的郭三堆等人在国内首先人工合成了 Bt 基因之后,又对豇豆胰蛋
27、白酶抑制剂(CpTi)基因进行了修饰,构建了同时带有这两种基因的双价杀虫基因高效植物表达载体,再通过花粉管通道转化技术导入我国不同棉花生产区的主栽品种,已获得了数十个双价转基因抗虫棉株系。南京农业大学等单位培育出的转基因抗虫棉南抗 3 号,具世界该种业领先水平。南抗 3 号是我国“863”重点攻关科技项目,该品种具有较好的丰产性、优质性和适应性,产量比国外基因棉种增产 20%以上。这一成果引起世界农业专家和跨国种业公司的强烈关注和震惊。许多国家都投入大量资金研究开发利用转基因抗虫农作物新品种。Bt 抗虫棉在美国、澳大利亚、南非和我国已被批准商业化释放;Bt 土豆在美国、加拿大和日本实现了商业化
28、;Bt 玉米在美国、加拿大、阿根廷、日本和欧共体也进入了市场。这些转基因作物能减少杀虫剂和农药的用量,降低杀虫剂和农药及其残留物对食物链、水体造成的污染,从而有利于保护生态环境。相信在不远的将来会有更多的转基因抗虫农作物新品种问世。2.2抗病（抗病毒）长期以来,植物病害的防治主要靠抗病育种和合理栽培管理。采用有性杂交的方式来获得抗病品种存在着各种局限性,因为抗性基因是受多基因控制,并且往往与一些不良基因连锁在一起,而基因工程则是在单个目的基因上进行,具有快速性和定向性。另外抗病品种存在选育时间长、抗性容易退化等问题。1986 年美国科学家 Beachy 将烟草花叶病毒(TMV) 外壳蛋白基因导
29、入烟草获得了首例抗病毒转基因烟草。大田实验结果表明,在接种了 TMV 以后,转基因植物只有约 5%的植株得病,而对照植株的发病率为 99%。在抗病毒基因工程中,目前主要采用的方法是将病毒的外壳蛋白(CP)基因导入植物 ,使番茄、黄瓜、南瓜、甜椒等植物具有抗病性。1992 年美国国家科学院公布了 Hayakawa 研究小组利用禾谷类作物抗病毒外蛋白技术获得成功。我国也获得了多种转基因抗病毒植物,如将合成的 CMV 和 TMV 外壳蛋白基因用 Ti 质粒介导引入烟草良种NC89,得到了 TMV/CMV 的转基因烟草,并已获大面积推广。1999 年美国批准转基因抗病毒马铃薯、西葫芦、番木瓜品种进行生
30、产后,我国也有转基因抗病毒烟草、番茄和甜椒品种被批准商业化应用。荷兰的一家植物生物技术公司应用转基因技术培育出一种抗真菌草莓新品种,不仅能减少草莓的病害,并能延长草莓的保鲜期。2.3抗除草剂通过化学方法来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分。那些对威胁农业生产的重要杂草具有活性的除草剂同时也能显著地伤害作物,这就限制了这些除草剂的应用。目前,世界上采用的除草剂主要分为两大类:一类是通过破坏氨基酸合成途径来杀死杂草;另一类则是通过破坏植物光合作用中电子传递链的蛋白来杀死杂草。根据除草剂的特点,目前,耐除草剂的基因工程主要有两种策略:(1)修饰除草剂作用的靶蛋白 ,使其对除草剂不敏感,或促其过
31、量表达以使植物吸收除草剂后仍能进行正常代谢。(2)引入酶或酶系统,在除草剂发生作用前将其降解或解毒。这两种策略都已成功地应用。已实现商品化的有以下作物:(1)美国孟山都公司创制的一系列抗农达(草甘膦)的作物品种,如大豆、玉米、油菜、向日葵、甜菜。(2) 艾格福公司的抗草铵膦的作物品种,如大豆、玉米、油菜、甜菜、棉花、水稻。(3) 美国氰胺公司主要研制抗咪唑啉酮类除草剂的转基因作物,已成功的有玉米、油菜、甜菜、小麦。(4)杜邦公司研制的抗豆黄隆与阔叶散的大豆、棉花。(5)巴斯夫公司转基因拿扑净杂交种玉米 1997 年出售种子。(6)罗纳卜朗克公司研制的抗溴苯腈转基因棉花,1997 年种植面积达
32、20 万50hm2;抗溴苯腈烟草于 19971998 年向其他国家出售种子。法国、加拿大抗除草剂的研究以油菜为主。我国已获得的抗除草剂转基因作物有:抗 Bsata 水稻、小麦、抗 2,4-D 棉花、抗阿特拉津大豆和抗溴苯腈油菜和小麦。具有耐除草剂性状的作物在 1998年到 1999 年间对全球转基因作物增长的贡献最大(占转基因作物种植面积的 69%,即 830hm2)。2.4抗逆性根据植物抵抗逆境(如抗旱、抗热、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等)的生理反应,可以将自然界中多种适应性基因发掘出来,如将大豆的抗热性基因分离并转移到烟草中,并获得了成功。胡萝卜抗冻蛋白(AFPs)及其基因的发现,为植物抗寒基因
33、工程注入了新的活力。1999 年,Meyer 等17用农杆菌介导胡萝卜 AFP 基因重组子转化拟南芥,诱导了一系列低温调节蛋白的表达,使未经低温驯化的植株具有较强的抗寒能力。美国斯坦福大学把仙人掌基因导入小麦、大豆等作物,育成抗旱、抗瘠的新品种。我国在抗逆基因的分离、克隆和转化等方面的研究也有新进展,克隆的耐盐碱相关基因已在烟草、水稻、玉米和八里庄杨等植物中进行了遗传转化,获得了耐 2%氯化钠的烟草、耐 0.6%氯化钠的木本植物八里庄杨、耐 1.17%氯化钠的玉米及耐盐能力达到 0.5%氯化钠的水稻1819。2001 年,尹明安等20根据克隆的胡萝卜 AFP 基因 ,构建成植物表达载体 pBA
34、F,为农杆菌介导转化番茄、甜椒等作物奠定了实验基础。相信在不久的将来,会有各种具有强烈抗逆特性的转基因植物出现,使它们在逆境中能更好地生存。2.5丰产优质作物的丰产优质一直是人们所追求的目标。90 年代前在农作物上主要在于提高农作物产量,近期则侧重于提高品质。基因工程育种的主要目标就是优质丰产育种。目前改良作物产品质量的基因及应用主要有: 控制果实成熟的基因; 谷物种子贮藏蛋白基因;控制脂肪合成基因;提高作物产量基因等。迄今为止,世界上已有 43 种农作物品种得到改良,如水稻、番茄、马铃薯、瓜类、烟草等等。美国国际植物研究所的科学家们将大豆中的蛋白质合成基因导入马铃薯,培育出蛋白质含量接近大豆
35、的高蛋白马铃薯品种,深得农场主及消费者的青睐。韩国用转基因技术育成了一种便于淀粉加工的特异性微型薯种,个体如葡萄、结果性状也似葡萄,产量是普通马铃薯的 3 倍,淀粉含量达 40%。1994 年,美国Calgene 公司推出全球第一个商业化的转基因植物品种-转基因耐贮番茄品种Flaver Savr。科学家们在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究,美国的一家基因工程公司从矮牵牛中分离出一种新编码蓝色基因,导入玫瑰花中获得开蓝色花的玫瑰。英国21首先从金鱼草分离出开花基因,可以应用它在农业上控制开花的数量、时间及位置。美国和日本科学家还克隆出对花特异表达的莽草酸合成酶基因表达起诱导作用的转
36、录调节因子 EPF1,利用它不仅能设计花色花形,还能调节开花,改变早熟和晚熟作物的收获期22。法国与德国合作将某种基因导入蔷薇和菊花,使其枝数增加,花数大幅度提高,增加了切花数量,但未公开该基因是什么22。我国在利用基因工程改良植物品质上也取得了较大的成就,如叶志彪等创建的我国转基因耐贮番茄品种-华番 1 号23,1996 年成为我国第一个获准进行商品化生产的农作物基因工程品种。北京农林科学院将来自美国优质面包小麦品种CHEYENNE 的谷蛋白亚基导入到北京地区推广种植的抗病、高产品种,获得蛋白质含量较高的小麦类型,具有比较好的前景。2.6杂交育种24杂交种要得到大面积推广就必须解决制种的难题
37、。植物花粉的败育,我们称之为雄性不育,雄性不育的植株在杂交育种上有着十分重要的位置,植物基因工程技术的发展已经在一些转基因成功的植株上获得雄性不育特征,人们从花药不育和花粉形成的过程中,分离到特意的基因启动子、与核糖核酸酶基因连接,导入油菜等植物中,发现转基因的油菜中花粉形成不正常,出现败育,成为不育系。将核糖核酸酶抑制因子导入油菜中,使不育系变成恢复系。同样的道理,目前人们还用其他一些毒性基因导入植物中,使其在花药或花粉发育过程中表达,从而获得不育株。这样就为农作物杂交种育种提供了新的战略。美国和比利时采用此技术进行油菜杂交制种工作,使产量增加 1530%,他们已开始应用这一技术培育玉米、棉
38、花、苜宿的杂交制种工作。所以利用基因工程方法打破对自然突变的依赖,获得不育品种成为植物分子生物学研究中的热门课题之一,近十年已获得令人瞩目的成就。2.7生物固氮25农业生产中常需要施用大量的化学氮肥来调节土壤和作物间的氮素供需矛盾,化学氮肥的大量生产需要消耗大量能源,同时会造成严重的环境污染。而生物固氮不仅大幅度地节约能源并且不会对环境造成严重的污染。但迄今为止所发现的固氮微生物均不能在粮食作物水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬菜上固氮,即使少数可以,其固氮量也很少。所以这些农作物的高产不得不依赖化学氮肥。多年来科学研究人员一直致力于生物固氮的研究,近 10 年来,固氮基因工程得到了飞速发展,基
39、因组学和功能基因组学的建立赋予了生物固氮研究新的内涵和研究策略,为实现固氮研究的目标增添了新的动力。目前,固氮的基因工程主要是将克氏肺炎杆菌固氮基因(nif) 导入到不能固氮的微生物或者植物中 ,以获得固氮微生物或固氮植物。日本国立遗传研究所通过质粒 PRD1 将 nif 引入到根际微生物中,发现乙炔的还原能力增强 3 倍,在种植 120 天的水稻中有 1 / 5 的氮是来自这种转基因菌的固氮作用。中国科学院遗传研究所把带有固氮基因的质粒 PRD1从大肠杆菌 K12jc5564 转移到无固氮能力的水稻根系菌 4502Y 中,表现出较强的固氮能力,经测定接种有该菌的水稻发育明显优于对照植株。2.
40、8医药工厂化农业26转基因植物是现代生产药用蛋白的一个廉价表达的系统,称为分子药田(molecular medicine farming)或医药工厂化农业(medicine farming farming)它已成为目前植物基因工程的研究热点。转基因植物作为生物反应器生产医药产品表现出诱人魅力,如转基因烟草生产抗体,转基因土豆生产可食性疫苗等,前景十分广阔。植物医药基因工程是指把重组的编码药用活性多肽和疫苗基因导入植物,使转基因植物能够大量生产这些活性多肽和疫苗。这种策略不仅可以大大降低这些本来昂贵的药品的生产成本,而且简化了贮存方式。因此,在国际上植物基因工程研究的一个新发展趋势就是利用转基因
41、植物生产药物。这方面的工作最早是 1988 年比利时 PGS 公司的科研人员做的,本意是想让烟瘾君子们不用抽烟而只需拿烟叶闻闻或放在嘴里咀嚼就可过烟瘾,以此减少尼古丁对人体的毒害。他们将一种神经肽的编码基因转入烟草,得到的转基因烟草表达出高产量的神经肽。尽管他们的初衷未能实现,因为神经肽是通过血液运输起作用的,它在口腔中会被降解掉,但却意外地找到一条利用转基因植物生产神经肽的途径。此后,其他科学家们纷纷加入这一领域的竞争并且成果纷呈。1989 年美国斯格里普斯研究所利用转基因烟草高水平地表达了单克隆抗体,其表达量达叶子总蛋白量的 1.3%。根据计算,如果按照这种表达水平,美国只需将其烟草土地面
42、积的 1%(约 6000hm2)用来种植这种转基因烟草 ,就可以产生出 270kg 的抗体,足以提供给 27 万癌症患者 1 年治疗之用1。迄今世界范围内正在研究开发的转基因植物生物反应器生产药物、酶等 100 种以上,从而形成了一个新的领域。如今美国 Bioresouces 公司利用植物基因工程手段生产白细胞介素 2 (I L2);荷兰用转基因马铃薯生产人的血清蛋白;韩国用转基因烟草和番茄生产人的胰岛素。我国克隆的天花粉蛋白的基因已成功地在转基因烟草中表达。3潜在的应用问题3.1植物基因工程与农业资源遗传多样性保护27据估计目前世界上共有 30000 余种陆生高等植物,而人类粮食的负重却几乎
43、完全压在少数的二十几个作物品种上,现代农业在选择良种的同时已不知不觉地淘汰、丢弃了大量所谓低劣的原始品种,造成了农业遗传多样性的极大损失。这种农业资源的单一和贫乏已使当代农业处于十分脆弱的状态。理论上,植物基因工程能够创造出新的品种甚至物种,丰富种质资源库。但另一方面,大规模推广和集中种植这样的高产、优质和抗逆新品种,淘汰大量旧品种,甚至完全取代原有物种,就很可能加剧作物遗传资源的均一化和贫乏化,不利于物种多样性的保持和利用。农业遗传多样性是农业生产力的基础,农业遗传多样性的贫乏直接影响到未来农业的可持续发展,从而将会对人类的生存和发展提出严重的挑战。所以转基因作物育种是对常规育种的一种超越和
44、补充,植物基因工程必须与常规育种紧密配合,才可能最终取得经济效益和社会效益。同时必须把目的基因开发利用与生物基因文库保存有机地结合起来。3.2 植物基因工程与病虫抗药性病虫抗药性是困扰农业生产的重大问题。基因工程的操作是否会引起新的病虫抗药性,将成为抗虫基因的发展能否继续迈向成功的关键。根据进化论的观点,由于生物共进化,引起病虫害的病毒和昆虫也如抗性植物一样能在不良生境下生长,并很快对不良环境产生适应,由此会产生转基因植物的抗性与病虫抗药性相互增长的恶性循环。抗虫植物基因工程任何依赖单一抗性因子的行为都是极其危险的,但是多种抗虫基因的同时开发、利用,对于控制抗虫产生抗性,提高抗虫植物的抗虫能力
45、及抗虫范围也是可以持乐观态度的。3.3植物基因工程与环境生态平衡28转基因作物的逃逸或由于作物杂交而获取了转基因抗性的植物不仅会给人工群落带来极大不利,而且会对自然植物群落产生严重的不良影响。如已俘获了毒蛋白基因的杂草对除草剂产生了抗性,而且可能会由于食草动物难以伤害它而加剧繁衍蔓延;俘获了抗逆基因的杂草增强了其对环境的适应和生存竞争力 ;俘获了抗性基因的害虫抗性交替进化;稀有植物品种也许会由于竞争替代而消失 ;同种植物的遗传多样性会减少;昆虫群落也会受到影响。此类现象一旦发生 ,基因工程带给人类的将不再是福音,而是一场灾难。因此,任何一种转基因植物释放到大田中时,应持十分谨慎与科学的态度。同
46、时要采用有效的措施如时间隔离、空间隔离和遗传隔离等方法控制植物基因逃逸,以降低其对环境生态所带来的危害几率。4. 展望毋庸置疑,在过去的二十年中植物基因工程已取得了重大进展,目前,一个完整的植物基因工程的理论和技术体系已基本建立,开始走向商业化。新的具有市场潜力的目的基因将被不断开发出来,有重大经济价值的转基因植物将陆续进入大田,不久的将来,可望出现高产优质、集高光效、抗病、抗虫和抗逆等特性于一身的作物新品种。生产符合人类需要的基因食品已经越来越明朗化和可操作化。转基因食品的安全性问题必将随着科学的发展被人类解决。21 世纪植物基因工程的在农业上的发展前景将是非常美好和令人鼓舞的,许多科学家甚
47、至预言,21世纪的所有主导农作物都将是基因工程产品。当然,要实现这一目标尚需时间和努力,但我们深信,植物基因工程将在第二次“绿色革命”中发挥巨大的作用。疫苗技术是人们从导致人畜疾病的病毒或者细菌中分离出蛋白，经过重组改造后，再转到其他生物中，使之产生抗原蛋白。植物基因工程疫苗是利用植物系统表达病原菌抗原蛋白的一个或几个亚单位,它没有病原菌完整的侵染能力,却可以使机体对特异的病毒或细菌产生免疫应答反应1。用植物基因工程技术生产疫苗方法与用微生物和动物生产疫苗方法相比，具有明显的优势，具体表现为： 成本低及使用方便。植物是最经济的蛋白质 1表达系统，只需要消耗阳光、肥料和水，不需要专门的设施和昂贵
48、的设备，而且部分转基因植物疫苗可以直接口服接种，既节省了提取、纯化和保存的成本，又能够使接种者免受皮肉之苦，使接种易于推广，特别适合于儿童接种。 生 2产速度快。不同于动物细胞的是植物的组织、细胞、原生质体均能够在离体的条件下诱导再生一株完整的植株。植物细胞培养、种植条件简单易成活，一旦获得高效表达载体，就可以在较短的时间内大量繁殖出具有相同遗传背景的无性繁殖系，只需增加耕种面积，就能够迅速形成产业化规模。 能进行有效的 3翻译后加工。植物细胞和动物细胞一样，均有着一套完善的真核表达系统，具有与动物细胞相似的翻译后加工过程，适合于动物病毒抗原的表达，表达产物具有与动物细胞相似的免疫原性。植物表
49、达系统生产的蛋白质疫苗可以进行正确加工，包括糖基化、磷酸化和酰胺化等，可保持自然状态下的免疫原性。目前医药生产常用的微生物发酵系统不能够对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后加工，有时可以导致其免疫原性变弱。 安全性好。动物细胞生产基因工程疫 4苗，常常利用动物病毒作为载体导入抗原基因，在生产过程中可能污染动物病毒，这些病毒对人类具有潜在的危害性。转基因植物只表达亚单位疫苗，不含致病微生物或者潜在的致病微生物，对人畜安全。 启动粘膜免疫。粘膜免疫 5是病毒性腹泻的免疫保护机制，在启动粘膜免疫方面尚属难题。转基因植物细胞是可以启动粘膜免疫的有效途径，其机制可能是植物细胞壁给抗原提供了一种生物微囊，生物微囊可以保护抗原不被消化酶降解，并有缓释作用。 易于 6运输。植物基因工程生产的疫苗可以直接储存在种子或者果实中，无需冷冻系统设备进行储藏运输，易于进行长距离运输和普及推广。植物基因工程疫苗的研究现状: 到目前为止，在植物中表达用于疫苗研究的病原基因主要有：乙型肝炎表面抗原（HbsAg）基因、大肠杆菌热敏肠毒素B 亚单位（ LT-B）基因、霍乱弧菌毒素 B 亚单位（CT-B）基因、诺沃克病毒外壳蛋白
