1、微生物的生化鉴定,微生物生化鉴定,微生物在代谢过程中，由于各自独特的酶系统，其分解与合成代谢产物各不相同。这些代谢产物各具不同的生化性质，利用生物化学的方法测定这些代谢产物、代谢方式和条件等来鉴定细菌的类别、属种，称之为生化试验，也称生化鉴定。,微生物分类鉴定的生理生化特征,生化鉴定中依据的微生物的生理特征有： 需氧性 温敏性 噬盐性 与宿主的关系 生活史等,生化鉴定中依据的微生物的生化特征有： 营养类型 对碳源的利用能力 对氮源的利用能力 对生长因子的需要 对抗生素及抑菌剂的敏感性 代谢产物 对pH的适应性等,生化鉴定注意事项,待检菌应是纯种培养物 待检菌应是新鲜培养物 遵守观察反应的时间
2、必要的对照试验 注意提高阳性检出率等 试验中至少挑取2-3各待检的疑似菌落分别进行试验。,微生物学检验细菌鉴定的生化试验,糖（醇）代谢试验 氨基酸和蛋白质的代谢试验 碳源和氮源利用试验 酶类试验 抑菌试验,.碳水化合物的代谢试验,糖（醇）类发酵试验 甲基红试验（MR） V-P试验,1.糖（醇）类发酵试验,是鉴定细菌的生化试验中最主要的试验 原理：不同种类细菌含有发酵不同糖类的酶，因而对各种糖类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖类，其代谢产物可因菌种而异。 方法：在基础培养基中加入特定糖（醇、苷）类。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35孵育箱内孵育数小时到两周后，观察结果。若用微量
3、发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥 。,结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。 应用：可以用来检查细菌对培养基中所含糖降解后产酸或产酸产气的能力，因此常用以鉴定细菌种类。,导管,气泡,培养基未变色、无气泡产生,培养基变为黄色,阳性,阳性,阴性,对照,2. 甲基红（MR）试验,应用：甲基红试验通过指示剂的显色反应可判断菌种为阳性还是阴性，常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别。 原理： 阳性菌包括大肠埃希菌、沙门菌属和变形杆菌属等，分解葡萄糖后可生成大量丙
4、酮酸，丙酮酸分解后又可生成醇、醛、酮、气体和水，反应后Ph4.5甲基红指示剂显红色。阴性菌则包括肠杆菌属和哈夫尼亚菌属等，分解葡萄糖后生成少量丙酮酸，丙酮酸分解后又可生成甲酸、乙酸和琥珀酸，反应后Ph5.4甲基红指示剂显桔黄色。 方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35孵育48h96h后，于5ml培养基中滴加56滴甲基红指示剂，立即观察结果。,结果：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。,MR +,MR -,3. VP （Voges-Proskauer）试验,原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在
5、碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物,即V-P试验阳性。 应用：主要通过测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力鉴别大肠埃希菌和产气肠杆菌，常与MR试验一起使用。 方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35孵育2448h，加入50g/L萘酚（95乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。,结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。,阳性,阴性,.氨基酸和蛋白质的代谢试验,吲哚试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 氨基酸脱羧酶试验 尿素酶试验,1.吲哚（靛基质）试验,原理：
6、某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。 培养基：蛋白胨水培养基。 方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。 结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,靛基质+,吲哚（靛基质）试验原理及照片,2.苯丙氨酸脱氨酶试验,原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。 培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。 方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35培养l824h，滴加1
7、0三氯化铁试剂34滴，自斜面上方流下。 结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。,出现绿色+,加氯化铁试剂,3.氨基酸脱羧酶试验,原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。 培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。 方法：将被检菌分别接种于赖氨酸培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35培养l4d，每日观察结果。 结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若
8、测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,试验管,对照管,阳性+,阴性-,对照管变黄,试验管变黄,4. 尿素酶试验,原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。 培养基：尿素培养基。 方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35培养l824h观察结果。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。,尿素酶试验图,阳性,.碳源和氮源利用试验,枸橼酸盐利用试验,1. 枸橼酸盐利用试验,原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生
9、成碳酸钠，使培养基变碱性。 方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35孵育14d，逐日观察结果。 结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。 应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。,阳性+,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,.酶类试验,氧化酶试验 触酶试验 凝固酶试验,1. 氧化酶试验,原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。 方法：用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺
10、试剂12滴在培养物上,再加入1% -萘酚-乙醇液12滴, 在30秒内判定试验结果。 结果：在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +；不变色或为红色者,为阴性,记 -。 应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。,不变色或为红色为-,成蓝色为+,2.触酶试验,原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。 方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加入3H2O2 1滴，立即观察结果。 结果：立即出现大量气泡为阳性,无气泡为阴性。 应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球
11、菌科阴性，故常用此试验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。,3. 凝固酶试验,原理：致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。 方法: 玻片法：在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性
12、对照）制成菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。 试管法：于试管内加1：4稀释的兔或人血浆0.5ml，再加12个待试菌菌落，置37水浴，每30min观察1次结果。,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,结果：玻片法：510s内出现凝集者为阳性。试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。 应用：本试验仅用于致病性葡萄球的鉴定。,.抑菌试验,奥普托欣敏感试验,1. 奥普托欣（Optochin）敏感试验,原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。 方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5g奥普托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱，35 孵育1824h，观察结果。 结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于 14mm为阴性。 应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）与其它链球菌（耐药）的鉴别。,
